丹參對大鼠皮膚創傷修復及血管內皮生長因子表達的影響

盧尚兵，金 昊，趙鑫鑫，朱 玲，李俊岑，曾 茜，李 龍，康春雨

(1.米蘭柏羽醫學美容醫院美容整形外科 四川 成都 610041；2.成都醫學院實驗技術教研室 四川 成都 610081)

皮膚創傷后修復過程復雜，大致經歷以下三個階段：①止血和炎癥反應階段；②細胞增殖分化階段；③組織重建或瘢痕形成階段[1]。如何縮短愈合周期，減少感染發生，是臨床外科醫生所面臨的難題。據文獻報道[2]：丹參是皮膚愈合，創傷修復的良藥，但其中的分子機制尚待闡明。本文通過建立大鼠皮膚創傷修復模型，探討丹參對傷口愈合的作用以及對創傷后血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達的影響，為進一步闡明其潛在的修復分子機制提供實驗依據，也為臨床治療皮膚創傷提供新的思維。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：取3月齡SD品系大鼠36只，雌雄不限，體重200～220g，平均(200±20)g，由四川省醫學科學院·四川省人民醫院實驗動物研究所提供，生產許可證號：SCXK(川)2013-15。

1.2 藥品和試劑：丹參注射液（國藥準字Z51021303，5支/盒，四川升和藥業股份有限公司生產）置冰箱4℃保存；免疫組化所用一抗：VEGF Antibody(貨號BA0407)，效價1:200，抗體來源為兔，購自Boster Biological Technology；二抗：購自中杉金橋的SP-9001兔SP檢測試劑盒，批號：17173A02；B液：生物素化山羊抗兔二抗工作液；C液：辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。

1.3 實驗儀器：智能程控生物組織自動脫水機：TC-120（泰維科技生產）；生物組織自動包埋機：TB-718（泰維科技生產）；輪轉切片機：RM2235（Leica BiosystemsNusslochGmbh生產）；電腦生物組織攤烤片機：KD-T（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司生產）；電熱恒溫培養箱（型號：HROP-80AB，青島海爾特種電冰柜有限公司生產）；生物顯微鏡（型號：BA210，麥克奧迪實業集團有限公司生產）。均由成都醫學院實驗技術教研室提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 創傷模型制備：36只3月齡SD大鼠，隨機分為丹參組和對照組。將所有SD大鼠適應性喂養1周，實驗前1d脫毛，稱重；用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉(劑量：1ml/kg) ，固定大鼠于手術臺上，常規消毒；在距脊柱0.5cm處，用刀將1.5cm×1.5cm范圍內的皮膚切除，但不傷及脊柱旁肌肉上的脂肪及筋膜，簡單包扎后待后續處理。

1.4.2 創傷修復：造模成功后，大鼠單籠飼養。術后1h開始用藥，丹參組用丹參注射液噴灑創面（劑量：1ml/只），對照組用相同劑量的生理鹽水噴灑創面。各組每日09:00、18:00各噴1次，持續1周，給予標準飼料喂養，供給清潔水，動物飼養室溫維持在25℃～30℃，鼠籠每隔2d重換墊料。

1.4.3 組織取材：按術后1d、3d、7d時間點取材，取材前行3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，切取距離創緣8mm以內的皮膚全層組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4.4 HE染色和免疫組織化學染色（immunohistochemistry staining, IHC）：標本用4%多聚甲醛固定后制作5μm厚的石蠟切片。每例標本間隔取石蠟切片20張，入60℃烤箱30min，梯度酒精水化，一部分常規HE染色，另一部分高壓熱抗原修復，非生物素二步法進行VEGF免疫組化染色：用3% H2O2預處理10min，封閉內源性過氧化酶，用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次2min。用正常山羊血清在37℃溫箱中封閉非特異性抗原10min。用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次2min。用VEGF抗體（效價1:200）孵育切片，入冰箱（4℃）過夜，用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次2min。用羊抗兔二抗37℃恒溫孵育30min，用PBS洗3次，每次2min；把切片入DAB-H?2O2顯色液，室溫下反應，待顯色充分，及時用0.01mol/L PBS漂洗2次，每次2min；蘇木素復染，梯度灑精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

1.4.5 陰性對照實驗：用PBS代VEGF抗體，其余步驟不變。

1.4.6 觀察指標

1.4.6.1 未愈面積的測量：造模成功后，采用OLYMPUS數碼照像機采集每只動物造模后1d、3d、7d的未愈面積圖像，然后利用Image-Pro Plus6.0圖像處理軟件( Mdia Cybernetics公司，美國)測量面積, 并記錄。

1.4.6.2 平均光密度值（MD）測定：將各組免疫組化切片置于光學顯微鏡下，采用OLYMPUS數碼照像機采集圖像進行觀察分析。在400倍下從每張切片中各隨機選擇5個視野進行拍照。然后用Image-Pro Plus6.0圖像處理軟件對染色陽性的細胞進行光密度分析，測量陽性細胞的平均光密度值。

1.5 統計學分析：各組未愈合面積和平均光密度值數據以均數±標準差表示，用SPSS20.0軟件包，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用方差分析LSD 法。

2 結果

2.1 兩組創傷未愈面積測量結果：損傷后1d、3d、7d對照組和丹參組大鼠創傷皮膚未愈合面積均逐漸縮小，3d、7d丹參組未愈合面積均小于對照組(P＜0.05)。見圖1，表1。

圖1 兩組創傷皮膚未愈合創面

表1 兩組創傷后不同時間段未愈合面積測量結果

表1 兩組創傷后不同時間段未愈合面積測量結果

注：*表示與對照組比較，P＜0.05

組別 例數 未愈合面積（mm2）1d 3d 7d丹參組 18 131.85±11.451 82.38±3.392* 4.02±0.217*對照組 18 138.61±3.637 132.85±1.321 14.21±1.617

2.2 HE染色結果：損傷后1d，丹參組和對照組鏡下均可見真皮層毛細血管擴張充血，大量紅細胞散布于組織間隙，小血管內紅細胞淤積形成血栓，損傷周圍見少量中性粒細胞浸潤，表皮層可見少量炎性細胞浸潤。見圖2A、D。

損傷后3d，大量肉芽組織形成并向創口生長。各組真皮層和表皮層均可見明顯擴張的毛細血管，損傷區周圍可見毛細血管生成，大量中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，除炎癥細胞外，尚可見大量成纖維細胞。丹參組小血管內紅細胞淤積情況較對照組輕，新生毛細血管數量較對照組多。見圖2B、E。

損傷后7d，各組創口已基本為肉芽組織填平，創口基本愈合。成纖維細胞大量增殖，分泌膠原蛋白。肉芽組織纖維化，向瘢痕組織轉變。損傷區周圍炎性細胞少見。見圖2C、F。

圖2 兩組創傷皮膚組織HE染色結果

2.3 免疫組化染色結果

2.3.1 損傷邊緣皮膚內VEGF免疫陽性反應物的分布概況：在本實驗中觀察到VEGF在動物皮膚表皮細胞、皮脂腺上皮細胞、毛囊、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞中有表達，但以成纖維細胞的表達為主，陽性反應物主要定位在胞核、胞漿和基質中。

2.3.2 皮膚創傷后VEGF的變化情況：損傷后1d，各組皮膚表皮細胞、皮脂腺上皮細胞、成纖維細胞的胞漿內可見VEGF免疫反應陽性物。在浸潤的中性粒細胞中少數細胞胞漿中呈VEGF陽性染色，在擴張的血管內皮細胞中也可見VEGF陽性表達。經平均光密度值測定，丹參組VEGF表達強度高于對照組(P＜0.05)。見圖3A、D。

損傷后3d，損傷區成纖維細胞大量增殖，炎癥細胞浸潤，VEGF在表皮細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞的胞漿表達增強，表達強度明顯高于損傷后1d(P＜0.05)。丹參組VEGF表達強度仍高于對照組(P＜0.05)。見圖3B、E。

損傷后7d，各組皮膚表皮細胞、皮脂腺上皮細胞、成纖維細胞的胞漿內VEGF免疫反應陽性物減弱，較損傷后3d比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。丹參組VEGF表達強度與對照組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3C、F。見表2。

免疫組織化學方法對照實驗結果均為陰性。

圖3 兩組創傷皮膚組織免疫組織化學染色結果(400×)

表2 兩組VEGF免疫反應陽性物平均光密度值

表2 兩組VEGF免疫反應陽性物平均光密度值

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示組內比較，P＜0.05

組別 例數 平均光密度值1d 3d 7d丹參組 18 0.21±0.003* 0.36±0.056*,# 0.19±0.042#對照組 18 0.17±0.015 0.23±0.011# 0.18±0.009#

3 討論

3.1 丹參對大鼠皮膚創傷修復的促進作用：丹參為唇形科多年生草木植物，是中醫活血化瘀的代表性藥物。大量臨床實踐證明，丹參可通過促進微循環、免疫調節、抑制過再生、減輕組織缺血-再灌注損傷、促進創傷組織再生、抑制炎癥反應及細胞凋亡等多個方面促進創傷組織修復[2]。本次研究中大鼠在皮膚創傷后不同時間點，對照組和丹參組的未愈皮膚面積均逐漸縮小，3d、7d丹參組未愈合面積均小于對照組（P＜0.05），表明丹參對大鼠皮膚創傷修復有促進作用。組織病理學結果顯示：損傷后1d，丹參組和對照組鏡下均可見真皮層毛細血管擴張充血，血管內有血栓形成，損傷周圍有炎性細胞浸潤，此時處于止血和炎癥反應階段。損傷后3d，大量肉芽組織形成并向創口生長，進入細胞增殖和分化階段，兩組損傷區域周圍均可見新生毛細血管及大量成纖維細胞，且丹參組小血管內紅細胞淤積程度較對照組輕，新生毛細血管數量較對照組多，表明丹參不僅可減少修復損傷過程中的血栓形成，還能通過促進毛細血管增生，加速創傷組織修復。損傷后7d，進入組織重建或瘢痕形成階段，創口已基本為肉芽組織填平，成纖維細胞大量增殖，并分泌膠原蛋白；肉芽組織纖維化，向瘢痕組織轉變，此階段丹參組與對照組組織病理學改變相似。

目前認為丹參對血管新生的調節作用呈雙向性[3]，Bian W等[4]研究發現丹參的活性成分二氫丹參酮Ⅰ可抑制毛細血管內皮細胞增殖和遷移，從而抑制血管生成。因此，其對腫瘤細胞有毒性作用。Luo Y等[5]研究發現隱丹參酮能通過抑制VEGFR-3 而調停細胞外調節蛋白激酶磷酸化，從而抑制淋巴內皮細胞的血管形成。然而，在劉暖[6]、張淑娟[7]等關于心肌梗死的研究中發現丹參提取物可以促進大鼠心肌梗死后心肌組織血管新生，并且在其他心腦血管疾病研究中也有類似的實驗結果[8-9]。因此，丹參在不同的疾病或組織中，對血管新生具有不同的調節作用。本研究結果顯示：在細胞增殖和分化階段，丹參可促進創傷皮膚真皮層及表皮層的毛細血管增生，加速損傷修復。

3.2 丹參上調VEGF的表達水平促進創傷修復：VEGF是一種對血管生成有極強誘導作用的多功能誘導因子，能特異性作用于血管內皮細胞，具有促進血管內皮細胞分裂、增殖、細胞質鈣聚集以及誘導血管生成、使血管通透性增強等作用，是已知促血管生成所有因子中的最強因子[10-12]。研究顯示，其在心腦血管疾病、腎臟疾病、創傷修復及腫瘤的形成中均有重要作用[13-14]。本實驗通過免疫組織化學染色方法對損傷邊緣皮膚內VEGF免疫陽性反應物的分布進行觀察，并對VEGF陽性反應物進行了光密度檢測，以實現對其表達水平的半定量分析。結果顯示：VEGF在大鼠皮膚表皮細胞、皮脂腺上皮細胞、毛囊、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞中均有表達，但以成纖維細胞的表達為主。目前研究表明，正常皮膚表皮中有少量 VEGF存在，具有維持自身穩態的作用[15-16]。Corral 等[17]研究發現VEGF mRNA 在皮膚損傷后表達可提高 6～7倍，可持續至傷后10d，提出VEGF在局部創傷修復中的作用超過了堿性成纖維細胞轉化因子。因此，VEGF在皮膚損傷修復中起有益作用。

相關文獻報道[18]，皮膚損傷后，隨炎性細胞的趨化、滲出，VEGF在表皮及毛囊上皮細胞的表達逐漸減弱，而在中性粒細胞、巨噬細胞及成纖維細胞的表達逐漸增加，巨噬細胞等炎性細胞產生VEGF，TGF-β等多種細胞因子參與創傷的愈合過程。本研究結果顯示：3d、7d后成纖維細胞的胞漿內可見VEGF免疫反應陽性物，明顯多于傷后1d；經平均光密度值測定，1d、3d后丹參組VEGF表達強度高于對照組，而7d后丹參組VEGF表達強度與對照組比較，差異無統計學意義。提示丹參可增加創傷修復過程中止血和炎癥反應階段和細胞增殖分化階段VEGF的表達水平。目前，國內外已有大量研究表明丹參可以調節VEGF的表達。高麗等[19]提出丹參酮ⅡA可通過抑制VEGF的表達抑制乳腺癌細胞株MDAMB-231的體外血管生成擬態的形成和細胞增殖。周利紅等[20-21]研究也證實，丹參酮ⅡA能夠通過抑制VEGF的表達從而明顯抑制小鼠腸癌皮下移植瘤內血管新生。而Wang W等[22]研究證明丹參酮ⅡA可抑制 VEGFR-1影響腫瘤血管內皮細胞(TECs)的血管形成功能。以上研究均表明丹參的活性物質能夠調節VEGF的表達水平，結合本實驗結果，筆者認為丹參可通過上調VEGF的表達水平促進皮膚創傷修復。此外，也有研究提出隱丹參酮能夠通過影響TGF-β1、b-FGF、bax、bcl-2、NF-kB等多種細胞因子誘導平滑肌細胞增殖、遷移及血管生成[3,23-24]。因此，丹參對損傷修復的作用機制并不是通過單一因子的調節，而是一個復雜的分子網絡，值得進一步深入探索。

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