低氧條件下辛伐他汀對瘢痕疙瘩成纖維細胞功能的影響

姚 建，蘇開新，王海華，郭 虎

（株洲市中心醫院燒傷整形外科 湖南 株洲 412007）

目前瘢痕疙瘩的發生主要與功能異常的成纖維細胞有關，治療藥物作用機理為抑制或阻斷瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、侵襲及膠原形成等生命活動[1-3]。辛伐他汀除降脂作用外，還具有免疫調節和抗器官纖維化的作用[4-5]。辛伐他汀能明顯減少兔耳增生性瘢痕的形成[6]，還能抑制人鼻息肉成纖維細胞的增殖和膠原分泌[7]。研究表明，低氧也是瘢痕疙瘩發病的一個重要因素，可通過增加成纖維細胞中促血管形成因子合成、分泌等促進瘢痕疙瘩的發展[8-9]。但未見低氧條件下辛伐他汀對瘢痕成纖維細胞作用的相關報道。本研究探討低氧條件下辛伐他汀對成纖維細胞增殖、凋亡及瘢痕生成因子表達的影響及相關作用機制，以期為臨床應用辛伐他汀防治瘢痕疙瘩生成提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器：胎牛血清、DMEM培養基購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC、碘化丙啶（PI）購自美國BD公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo Fisher公司；CCK-8試劑、細胞裂解液、上樣緩沖液、脫脂奶粉、PVDF膜購自江蘇凱基生物技術公司；組織基質金屬蛋白酶抑制劑-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP-1)、結締組織生長因子 (connective tissue growth factor, CTGF)抗體購自美國CST公司；低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、Ⅰ型膠原購自美國Sigma公司；Caspase-3、β-actin、Bax、Bcl-2抗體和二抗購自武漢三鷹生物技術公司 (Proteintech Group,Inc)；ECL顯色試劑盒購自上海翊圣生物科技公司。酶標儀(Bio-Tek，美國)，細胞培養箱(Thermo Fisher，美國)，流式細胞儀(BD，US)。

1.2 細胞培養和分組：瘢痕疙瘩標本取自株洲市中心醫院整形外科就診患者，患者術前1周未接受任何藥物和手術治療，患者均知情同意，并經本院醫學倫理委員會批準。將瘢痕疙瘩組織去除表皮和皮下組織后，剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，均勻平鋪于75cm2培養瓶中，放入37℃、5% CO2的細胞培養箱中進行培養，每3d更換1次新鮮培養基。1～2周后原代細胞爬出組織塊并匯合成片，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取4～6代生長狀態良好的細胞進行干預研究。將含2% O2低氧培養箱中培養36h的成纖維細胞設為對照組，對照組基礎上添加10μmol/L辛伐他汀處理成纖維細胞設為干預組。辛伐他汀購自中國藥品生物制品檢定所，用二甲基亞砜配制成濃度為10mmol/L的辛伐他汀母液，過濾除菌后，待用。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖情況：將生長狀態良好的成纖維細胞以每孔5 000個/100μl接種于2塊96孔板，培養24h后去除96孔板中的培養基，各孔加入100μl含辛伐他汀濃度分別為0、0.1、1、10、50、100μmol/L的培養液，每個濃度均設置3個復孔，藥物添加后常氧培養箱和2% O2低氧培養箱各放置1塊96孔板處理36h，培養結束后加入100μl DMEM、10% CCK-8溶液，37℃孵育2h上機檢測450nm波長處的吸光度值，實驗重復4次。細胞存活率計算方法：細胞存活率(%)=(干預組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡：在低氧條件下用10μmol/L辛伐他汀處理成纖維細胞36h，收集兩組細胞，PBS懸浮漂洗2次，每個樣品加入5μl Annexin V-FITC按照試劑盒說明書操作進行染色，避光反應0.5h，加入10μl PI后1h內完成流式細胞儀上機檢測，實驗重復3次。

1.5 Western blotting法檢測蛋白表達：在低氧條件下用10μmol/L辛伐他汀處理成纖維細胞36h，收集兩組細胞并充分裂解，離心收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，高溫水浴使蛋白變性，使用微量進樣器上樣（上樣量為20μl），SDS-PAGE電泳分離，將目標蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉，一抗孵育4℃過夜，其中β-actin抗體稀釋比例為1:2 000，其它抗體稀釋比例為1:1 000，一抗孵育結束后洗膜，孵育二抗，二抗稀釋比例為1:5 000，ECL化學發光法顯色，定影，拍照，使用Image Pro Plus6.0軟件對圖片進行灰度掃描半定量分析，實驗重復3次。

1.6 統計學分析：統計分析采用SPSS20.0軟件，數據以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1 辛伐他汀在低氧條件下對成纖維細胞增殖的影響：常氧和低氧條件下辛伐他汀作用36h，隨著藥物濃度的增加成纖維細胞存活率逐漸降低，差異有統計學意義(P＜0.01)；當藥物濃度≥10μmol/L時，與常氧組相同濃度比較，低氧組細胞存活率顯著減小，差異有統計學意義(P＜0.01)，結果說明低氧條件下辛伐他汀對細胞增殖的抑制作用更強。見表1。

2.2 辛伐他汀在低氧條件下對成纖維細胞凋亡的影響：辛伐他汀作用36h，干預組成纖維細胞凋亡率明顯大于對照組，組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。Western blotting結果顯示，與對照組比較，干預組細胞促凋亡因子Bax、Caspase-3表達增加，而凋亡抑制因子Bcl-2表達減少，見圖2。以上結果說明低氧條件下辛伐他汀可通過上調Bax、Caspase-3表達，下調Bcl-2促進成纖維細胞凋亡。

圖1 辛伐他汀在低氧條件下對成纖維細胞凋亡的影響

圖2 辛伐他汀對低氧條件下成纖維細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

2.3 辛伐他汀在低氧條件下對成纖維細胞中瘢痕生成相關因子的影響：與對照組比較，干預組成纖維細胞中瘢痕生成相關因子HIF-1α、Ⅰ型膠原、CTGF蛋白表達水平顯著低于對照組，TIMP-1表達水平則明顯高于對照組(P＜0.05)，見圖3。

圖3 辛伐他汀對低氧條件下成纖維細胞中瘢痕生成相關因子表達的影響

3 討論

瘢痕疙瘩的發生是多因素共同作用的一個復雜病理過程，而瘢痕成纖維細胞在其中扮演著重要角色。瘢痕疙瘩中的成纖維細胞增殖能力增強，凋亡率較正常皮膚成纖維細胞低，且對誘導凋亡的刺激耐受性增強，膠原合成能力增強，膠原降解能力減弱，并伴隨相關細胞因子及受體表達的改變，這些異常改變是導致瘢痕疙瘩發生的重要原因[10-11]。目前治療瘢痕疙瘩的藥物研究也主要集中在抑制細胞增殖，促進凋亡和減少細胞外基質合成，促進膠原降解方面[12]。此外，瘢痕組織中存在因血管閉塞等引起的血供不足及缺氧的微環境，可能是引起創傷過度愈合、皮膚纖維化增生形成瘢痕疙瘩的機制之一[13]。研究發現HIF-1α在病理性瘢痕成纖維細胞中顯著升高且促進成纖維細胞的增殖及活力，對瘢痕疙瘩的形成具有一定的促進作用[8]。低氧微環境與瘢痕成纖維細胞異常增殖及膠原合成、細胞外基質重塑紊亂密切相關[14]。尋找低氧條件下能夠抵抗瘢痕疙瘩形成的藥物，對治療瘢痕特別是有可能由低氧微環境引起的瘢痕疙瘩具有重要的意義。

表1 低氧和常氧條件下不同濃度辛伐他汀對成纖維細胞存活率的影響 (xˉ±s，n=4)

辛伐他汀是一種臨床廣泛應用的降脂藥，減少膽固醇生成，還具有免疫調節及抗炎作用，對心血管疾病、類風濕性疾病及各種器官纖維化疾病都具有保護作用。體外培養的系統性硬皮病成纖維細胞膠原合成增強，相關基因的轉錄也明顯增加，而辛伐他汀能干擾轉錄因子與I型膠原基因啟動子區的結合，從而減少I型膠原基因轉錄和蛋白合成[15]。本文通過模擬體內低氧病理微環境研究辛伐他汀對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡及瘢痕生成因子表達的影響。

結果發現，在低氧條件下，辛伐他汀能夠顯著抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖，促進細胞凋亡，并抑制HIF-1α、I型膠原和CTGF的合成，且辛伐他汀促進成纖維細胞凋亡與上調Bax、Caspase-3的表達及下調Bcl-2的表達有關。研究表明，辛伐他汀能抑制低氧刺激的細胞增殖，促進低氧下的血管形成[16-17]。低氧條件下，成纖維細胞HIF-1α表達增高，從而啟動與血管形成相關因子的基因表達，促進瘢痕生成[9]。辛伐他汀能明顯抑制兔耳增生性瘢痕部位CTGF的表達[6]，還可通過抑制CTGF的表達減輕大鼠炎癥性腸病腸纖維化進展[18]。這些研究結論為本研究結果提供一定支持。

本次研究還發現，辛伐他汀在低氧條件下能顯著增強TIMP-1表達。TIMP-1是基質金屬蛋白酶9 (MMP-9)的主要抑制劑，主要調節腫瘤的侵襲生長及血管形成。研究證實MMP-9在瘢痕疙瘩中高表達，促進瘢痕疙瘩向周圍浸潤生長[19]。TIMP-1表達上調可有效抑制MMP-9表達，從而抑制瘢痕疙瘩的侵襲及血管新生，后續將進一步研究證實。

綜上所述，辛伐他汀在低氧條件下可顯著抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的體外增殖能力，促進細胞凋亡，Bcl-2、HIF-1α、Ⅰ型膠原及CTGF蛋白表達水平顯著降低，Bax、Caspase-3及TIMP-1表達水平明顯升高，

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