普魯卡因慶大霉素口服溶液中硫酸慶大霉素含量測定方法的建立

劉 艷，金 鵬，王惠民

（淮安市食品藥品檢驗所，江蘇 淮安 223300）

普魯卡因慶大霉素口服溶液為復方制劑，其組分為每200 mL含硫酸慶大霉素160萬單位（按慶大霉素計）與鹽酸普魯卡因2 g。生產企業原標準中無主藥成分的含量測定，為建立較為完整的質量標準，達到有效控制產品質量的目的，我們增加了硫酸慶大霉素的含量測定方法。本法參考相關書籍文獻建立了抗生素微生物檢定法測定硫酸慶大霉素含量，用于多批樣品的測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀（北京先驅威鋒技術開發公司）；PYZ-DHS型隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；XS205電子天平（Mettler公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（Panasonic公司）。

1.2 試藥

短小芽孢桿菌[CMCC（B）63 202]；慶大霉素標準品（每毫克相當于630單位，批號為130326-201015，中國食品藥品檢定研究院）；3批普魯卡因慶大霉素口服溶液（200 mL：硫酸慶大霉素16萬單位（按慶大霉素計）與鹽酸普魯卡因2 g，批號分別為160831、160901、160902，由生產廠家提供）；陰性樣品（由生產廠家提供）；抗生素檢定I號培養基（高pH），批號為3105457，廣東環凱微生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1 菌懸液的制備

取經過預試驗的試驗菌液適量加至培養基中，搖勻，備用。

2.1.2 標準品溶液的制備

精密稱取慶大霉素標準品適量，加滅菌水溶解并制成約1000單位/mL的溶液，精密量取適量，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液（pH7.8）稀釋成約12單位/mL（S2）和3單位/mL（S1）的溶液。

2.1.3 樣品溶液的制備

精密量取樣品5 mL，置40 mL量瓶中，用滅菌水稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液（pH7.8）稀釋成約12單位/mL（T2）和3單位/mL（T1）的溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備

精密量取不含硫酸慶大霉素的陰性樣品，同“樣品溶液的制備”方法配制。

2.1.5 培養與測試

照抗生素微生物檢定法（《中國藥典》2015年版四部通則1201[1]）測定。方法中高、低劑量為1:4，培養溫度35～37℃，培養時間14～16小時；

2.2 對新方法的驗證

按《中國藥典》2015年版四部通則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則[2]、《中國藥典分析檢測技術指南》抗生素微生物檢定法[3]與《藥品微生物學檢驗技術》抗生素微生物鑒定法[4]對新建方法進行驗證。

2.2.1 專屬性

取陰性樣品溶液，按上述培養方法進行測定，未產生抑菌圈，對結果無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.2.2 線性與范圍

根據硫酸慶大霉素的對數濃度（劑量）與抑菌圈（反應）關系的直線范圍內，選擇一個中心濃度C0為5單位/mL；按劑距為1:0.8，各劑量按等比級數稀釋成系列濃度，每個濃度為一組，設10組，每組5個碟子；在各雙碟菌層培養基表面，按等角距位置安置4枚鋼管；在各組每個雙碟鋼管相隔的鋼管內，均滴加中心濃度溶液，其余兩個鋼管內滴加C1、C2、…Cn各濃度組溶液；滴加完畢后，將雙碟在規定溫度下培養14～16小時后，測定各抑菌圈直徑，計算。得出線性回歸方程y=0.6968+0.2192（X-17.7440）（r=0.9984），硫酸慶大霉素在濃度1.8225單位/mL～13.5790單位/mL范圍內與抑菌圈成線性關系，平均可信限率為6.7。

2.2.3 準確度

向不含硫酸慶大霉素的陰性樣品中加入已知量的硫酸慶大霉素對照品進行測定。精密稱取硫酸慶大霉素對照品制成每1 mL中分別約含80單位、100單位、120單位的溶液，分別用pH7.8的磷酸鹽緩沖液按1:4的比例稀釋成高低濃度溶液，作為對照品溶液。精密稱取硫酸慶大霉素對照品，分別加陰性樣品，用pH7.8的磷酸鹽緩沖液按1:4的比例稀釋成高低濃度溶液，為回收測試樣品溶液。普魯卡因慶大霉素口服溶液中硫酸慶大霉素含量約為1%，根據指導原則，回收率限度應為92～105%。取上述各溶液，按上述效價方法測定，結果為97～104%，在規定范圍內。

2.2.4 精密度

根據指導原則，精密度RSD應≤2%。取同一批號6份樣品，制備樣品溶液，按上述方法測定，計算結果分別為100.0%，100.8%，100.2%，100.3%，100.3%，100.5%，可信限率均不大于7%，平均值為100.4%，RSD為0.3%，在規定范圍之內。

2.2.5 穩定性

分別在0 h、24 h和48 h測定對照品溶液和樣品溶液抑菌圈，計算結果，含量分別為100.4%、100.4%、100.0%，RSD為0.3%，表明樣品在48h內穩定性良好。

2.3 樣品測定

取不同批號三批樣品，按以上擬定的含量測定方法檢驗，計算硫酸慶大霉素含量，測定結果為100.0%，101.3%，100.7%，可信限率均不大于7%。

3 討 論

本研究根據硫酸慶大霉素特點，并結合短小芽孢桿菌生長特性，建立了抗生物微生物二劑量法測定硫酸慶大霉素含量，該方法中形成的抑菌圈邊緣清晰大小符合規定，可以使用抑菌圈測量儀進行測量，可以大大提高測定結果的準確性。通過系統的方法學驗證，證明了新方法的可靠性，該方法可以作為普魯卡因慶大霉素口服溶液中硫酸慶大霉素含量的常規質量控制方法。