三大基因編輯技術簡介及其在畜牧育種中的研究進展

時偉程

【摘 要】隨著社會的進步和人們對美好社會需求的不斷提高，基因編輯技術迅速發展，被廣泛應用于生命科學領域。本文對基因編輯的三大技術方法進行簡要介紹，同時對其在畜牧育種中的研究進行綜述，并對未來基因編輯技術進行展望，以期為進一步研究基因編輯技術提供理論依據。

【關鍵詞】基因編輯技術；畜牧育種

基因編輯（Gene Editing）技術是指一種對目的基因或轉錄產物進行插入、敲除和定點突變等定點精確修飾的生物技術。該技術主要利用人工核酸酶實現對基因組上特定DNA片段的敲除、敲入或修飾。目前主要有三大基因編輯技術，鋅指核酸酶（ZFNs）技術，類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）技術和CRISPR/Cas9技術。近年來，這三大技術在畜牧育種中應用廣泛，在動物性狀改良方面起到了巨大作用。

一、鋅指核酸酶（ZFNs）技術

鋅指核酸酶（zinc finger nucleases， ZFNs）是第一代人工核酸內切酶，由鋅指蛋白（zinc finger proteins， ZFPs）的DNA識別結構與非特異性 FokI 核酸內切酶融合而成。ZFPs組成的 DNA 識別域包含至少三個Cys2His2鋅指蛋白可與目的基因位點結合，而FokI 是一種核酸內切酶發揮“剪刀”的功能，對目的基因進行剪切，由此達到基因編輯的。ZFPs 作為一類特殊的轉錄調控因子，在生物體的細胞分化、胚胎發育以及基因表達調控等多個方面發揮重要作用。

在動物活體細胞中，Bibikova等首次利用ZFN技術在非洲爪蟾卵母細胞中實現了基因打靶，從此， ZFNs技術開始被廣泛應用于多種哺乳動物的基因編輯中。2011年，Hauschild 等將 ZFNs基因組編輯技術應用于豬，利用基因打靶獲得了α-1，3-半乳糖基因敲除豬，為器官移植技術提供了新的思路。Whyte等將體細胞核移植技術與ZFNs技術相結合，從而獲得轉基因豬。2013年，Marron等利用ZFN技術成功在豬上敲除了MSTN基因，使得豬肌肉生長抑制素的形成被破壞，從而使得豬的瘦肉率得到顯著提高。Cui等在2015年利用ZFNs技術在豬上得到新的突破，獲得了具有生長激素受體的轉基因豬， 使得研究人類疾病有了理想的新動物模型。ZFNs技術研究在牛上研究同樣廣泛，2011年Yu 等利用ZFNs 技術，獲得了具有更高牛奶營養品質的轉基因牛，他們敲除了β-乳球蛋白基因，該基因在牛奶中具有致敏性。

ZFNs技術由于發現時間較早，研究廣泛，試驗技術雖相對完善，但脫靶現象嚴重，細胞毒性大等缺點使其進一步推廣應用受到嚴重制約。

二、類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）技術

轉錄激活因子效應物（transcription activator-like effector， TALE）和 FokI 連接構成了TALEN 結構。在ZFNs技術之后，TALEN是第二個被廣泛認可的基因編輯技術。TALEN技術在應用時，首先要設計TALE的識別單元，TALE的DNA識別域由多個重復氨基酸模塊組成，這些氨基酸序列十分保守。緊接著將識別單元與FokI相結合，構建TALEN質粒。TALEN技術的剪切機制是依靠TALE 特異性結合到靶位點上，其切割域形成特異性的二聚體，可使識別位點間的目標基因核苷酸實現斷裂，從而完成目的基因編輯。目前構建TALEN 的方法主要有：TALEs“黃金大門”克隆法；迭代帽組裝法；固相高通量自動連接技術；非連接酶依賴型克隆法等。

TALEN基因編輯技術被廣泛應用于多種飼養動物中，2012年Carlson 等利用TALEN 技術敲除了豬細胞中多個基因，為 TALEN 技術在轉基因豬上的廣泛應用提供了研究思路。2013年， Xin等又利用該技術將豬的GGTA1基因成功進行定點敲除。2014年，Li等在豬上發現了ROSA26 基因位點，并成功利用 TALEN 技術進行定點敲入。2015年，Wu等利用 TALE技術成功在牛的常染色體中敲入小鼠的 SP110 基因，從而得到了23 頭可抵抗牛結核分枝桿菌的轉基因牛。同年在轉基因羊的研究上，Cui 等利用TALEN技術將人乳鐵蛋白敲入羊的常染色體使其替代了羊自身的β乳球蛋白，從而使得羊奶的營養價值得到了顯著提高。

TALEN技術相較于ZFNs技術，其優勢在于可以定點識別目標基因，從而使得基因剪切編輯更加準確高效，同時與ZFNs技術相比它的脫靶效應以及細胞毒性都得到了有效改善。

三、CRISPR/Cas9技術

CRISPR/Cas9技術是一種由RNA介導的基因編輯技術，該項技術的興起引發了基因編輯領域新的革命。CRISPR是從對真菌和古菌宿主的研究中衍生而來的，1987年日本的Ishino等，在大腸桿菌的DNA中發現有串聯間隔重復序列的特殊結構交替出現。一直到2012年，這種重復序列才被命名為規律性聚簇間隔短回文重復即CRISPR。CRISPR系統可分為三大類型： I型、II型和III型，CRISPR/Cas9便屬于II型，II型系統相較于其他類型，結構較簡單， 只需要一個Cas9蛋白來識別目的基因序列。現在最簡便且應用最廣泛的CRISPR/Cas9 技術是將利用sgRNA引導Cas9 蛋白識別特定基因序列的PAM區，造成雙鏈 DNA 斷裂，并啟動 DNA 損傷修復機制。

目前CRISPR/Cas9技術在畜牧生產中被廣泛應用。2014年，Hai等利用CRISPR/Cas9技術編輯豬的vWF基因，從而為治療血管性血友病提供了新的研究模型。2015年，水牛 BMP15 和 GDF9 基因被CRISPR/Cas9 技術進行編輯，從而加快了水牛繁殖性能的提高。2016年， Han等使用CRISPR/Cas9技術敲除了豬的Hoxc13基因， 從而為人類治療外胚層發育不良提供了模型。2016年，在我國新疆，利用CRISPR/Cas9技術成功培育出具有不同毛色的轉基因綿羊。2017年，Gao 等首次將NRAMP1基因利用CRISPR/Cas9技術敲入奶牛的基因組中，成功獲得了轉基因奶牛共11頭，經研究發現，11頭奶牛均未發生脫靶效應，說明CRISPR/Cas9技術可使基因編輯脫靶效應降低，從而為進一步研究轉基因家畜提供理論基礎。此外，CRISPR/Cas9技術在小鼠細胞、恒河猴、食蟹猴、小鼠和人上均有相關研究報道。

CRISPR/Cas9技術與TALEN技術和ZFNs技術相比， 其切割效率相對較高且操作簡單。同時，能夠更為精確且高效的對目標基因進行定點編輯，并且同時進行多位點的編輯。CRISPR/Cas9 技術目前還具有一定的局限性，其受到 PAM 元件的制約，不能完全識別特異性的DNA序列。

四、展望

基因編輯技術被認為是一種理想的基因操作手段，至今已達到一定的高度，具有效率高、定向編輯準確性高、適應性廣等優點。隨著科學的快速發展，基因編輯技術必將不斷完善，通過敲除和敲入等手段獲得家畜優良的生產性狀，加快我國畜牧業發展的速度，從而為改善國民生活做出貢獻，此外也可利用基因編輯技術，建立動物研究模型，使其在生命科學和醫學方面更好的為人類服務。此外，基因編輯技術還存在脫靶率高、特異性以及效率低等問題，更加有效的利用基因編輯技術還有待進一步研究。隨著科學的發展，各種各樣的基因編輯工具不斷更新，使得人們對基因編輯的研究也更加深入，不過想要真正將其應用于畜牧育種中，還需科技工作者繼續努力。

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