BZR1基因表達模式分析

孫安南

摘 要：花藥是被子植物產生雄性配子體的重要生殖器官，它的正常發育對植物的繁衍和傳代非常重要。而植物生長發育的每一個階段，從種子萌發到開花結果，都受到體內激素的調控。目前，包括生長素在內的六大植物激素及其相應的信號調控通路參與調控植物生長發育過程的功能和機制研究已經被廣泛報道。其中，蕓苔素（brassinosteroids， BRs）是植物中一種促進生長的甾體激素，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的相關遺傳學研究奠定了BR在植物發育過程中的重要地位，BR合成以及信號傳導通路的相關基因也被報道在植物營養生長、葉片發育、開花、光形態建成以及雄性生殖等過程中發揮重要作用。目前，這些基因參與調控花藥發育背后的具體機制尚不清晰。我們通過運用mRNA原位雜交的方法分析了蕓苔素信號通路中編碼了轉錄因子的重要基因BZR1在擬南芥不同發育時期的花藥中的表達模式，為BR信號通路調控雄蕊發育的機制研究提供了新的認識和重要的參考。

關鍵詞：擬南芥；花藥；蕓苔素；BZR1；轉錄因子

中圖分類號：Q789 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）23-0199-04

雄性生殖在開花植物繁衍傳代的過程中發揮關鍵作用，對農作物的產量有重要的影響。雄性不育是指植物體中雄蕊發育由于受到內、 外因素的影響而發育不正常的現象，這種現象會嚴重影響作物產量。研究植物雄性生殖器官花藥的正常發育過程以及揭示參與調控這一過程的重要基因的功能，對于我們通過遺傳改良來增加糧食等作物的產量由重要的意義。

擬南芥植株小且產生的種子多，非常適合作為模式植物來進行遺傳學研究。擬南芥是十字花科植物，擁有六個雄蕊，四長兩短，四個較長的雄蕊被稱為四強雄蕊。雄蕊由花絲和花藥兩部分組成。根據細胞形態學特征，前人將擬南芥花藥的發育過程總共分成14個階段：發育到第5期時，具有四角結構的花藥原基孢子體細胞開始分化形成了由表皮層、內皮層、中間層、絨氈層，這四層體細胞包圍小孢子母細胞形成了花藥的典型的蝴蝶狀結構。第6-7期，小孢子母細胞經過減數分裂形成單倍體小孢子的四分體，四分體被胼胝質層包裹。花藥發育進入第8期時，胼胝質酶復合體降解了胼胝質層，小孢子從四分體中釋放出來，孢粉素等物質隨著絨氈層的降解，積聚到花粉母細胞表面，慢慢形成花粉壁。在第9到12期，經過兩次有絲分裂，三核的花粉粒形成；此后，花藥開裂，成熟花粉釋放。

在擬南芥中，絨氈層是一層特殊的細胞層，該類細胞內含較多的RNA和蛋白質，并有油脂和類胡蘿卜素等營養物質，為花粉粒發育提供了所需養料和信號分子。在花藥的正常的發育中，絨氈層細胞分裂、分化成體細胞層，包圍花粉母細胞（PMCs），絨氈層細胞的形成對成熟花粉的形成和釋放有直接的作用，因此直接決定了雄蕊的育性，進而影響植株的雄性育性。在花藥發育的第5期，各層細胞命運決定后，絨氈層細胞的超微結構與其他孢子體細胞并沒有明顯的差異。而在減數分裂期間，絨氈層細胞的細胞質則變得濃密，其中充滿了核糖體、線粒體、內質網、高爾基體等等，顯示其代謝高度活躍。減數分裂完成后，小孢子外的胼胝質在絨氈層分泌的胼胝質酶作用下降解，小孢子從四分體中釋放出來并開始發育成熟，而絨氈層進一步特化為海綿狀的細胞，分泌小泡釋放小孢子發育所需要的蛋白質、脂類及其他營養物質。在花粉第一次有絲分裂完成 時，絨氈層細胞開始降解，細胞膜破裂，細胞殘余與脂體釋放到花粉表面成為對花粉粘著和信號識別很重要的花粉包被。

近些年國內外以擬南芥為材料，在花藥發育過程中的分子調控機制研究取得了一定的進展，發現了多個雄性不育的突變體并克隆了相關基因，包括重要的轉錄因子如：DYT1、AMS和TDF1。DYT1在花藥發育的第5期和第6期有較高的特異表達，dyt1突變體絨氈層細胞出現提前的異常空泡化，向藥室內部擠壓且無法順利降解，生殖細胞不能發育形成成熟花粉粒。TDF1編碼一個在絨氈層、減數分裂細胞以及小孢子細胞中高表達的轉錄因子，TDF1突變后，突變體花藥的絨氈層細胞無法進一步分化并分泌胼胝質酶，從而導致小孢子母細胞的提前降解。AMS編碼了對于花藥絨氈層與減數分裂后小孢子發育至關重要的轉錄因子，在ams突變體中，絨氈層細胞在四分體被釋放后出現空泡化，小孢子在四分體時期后逐漸降解。

蕓苔素最早由Michelle于1970年發現，他從油菜（Brassica napus）花粉中提取出了一種能促進植物莖桿伸長和細胞分裂的高活性物質，將其稱為蕓苔素（brassinolide，BL），蕓苔素可以強烈誘導細胞的生長和分化，此后，具有與BL相似結構和活性的甾體分子不斷被發現，統稱為蕓苔素甾醇（brassinosteroids，BRs）。隨后，在擬南芥中，大量BR 相關的突變體被發現，BR在發育中的功能也逐漸清晰。目前，我們已經研究證明了BR信號通路相關的基因參與調控植物營養生長、葉片發育、開花、光形態建成以及雄性生殖過程。BR被認為是廣泛調控如細胞伸長、維管分化、根生長、對光的反應、抗逆、衰老等發育過程和生理過程的基本激素之一。這些基因除了編碼了受體蛋白激酶的BR INSENSITIVE 1（BRI1）、編碼擬南芥糖原合酶激酶3（GSK3）樣激酶的BR INSENSITIVE 2（BIN2）等外，還包括編碼轉錄因子的BZR1（BRASSINAZOLE RESISTANT 1）等。進一步的生物化學研究將這些組分整合起來，形成了一條連接從BR在細胞表面的感知到細胞核轉錄因子激活的磷酸化級聯反應，即BR信號通路。

BR影響植物雄性育性，而BZR1是BR調控下游基因表達的關鍵轉錄因子，但目前并未有BZR1在花藥發育過程中所發揮功能的研究報道。要了解基因功能，首先我們需要從目的基因的表達水平和模式研究入手，原位雜交（In situ Hybridization）是一種從細胞學角度研究基因表達水平和模式的有效的分子生物學技術，用原位雜交技術來探討植物基因的時空表達研究是一種重要且成熟的研究手段。因此確定BZR1基因在不同發育時期的花藥中的表達模式，可以為我們進一步了解BZR1在花藥中可能發揮的分子功能提供線索，從而為從遺傳上提高植物育性、增加作物產量提供一定的理論依據，無疑是必要且具創新性的。endprint

1 材料與方法

1.1 植物材料和植物培養

本研究所用到的擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）野生型（Col-0）植株材料為哥倫比亞（Columbia）生態型背景。擬南芥植物種子點播在PH值為5.8的1/2MS培養基上，4℃處理48h后轉入光照培養箱（16h光照8h黑暗），7天后將幼苗移栽至培養土中繼續生長，溫室的生長條件為：22攝氏度、濕度為65%、光周期為16h/8h（光/暗）。

1.2 植物總RNA的提取及反轉錄

首先取擬南芥花序，放入在1.5ml的離心管中，用液氮冷凍后研磨，待細胞組織破碎后加入1mL的Trizol試劑，劇烈震蕩15秒，在室溫靜置15分鐘。隨后再加入200微升的氯仿，震蕩混勻后靜置2分鐘，在4攝氏度以12000g轉速離心15分鐘，移取上層清液，轉入新的1.5毫升的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后，在-20攝氏度沉淀1小時。4攝氏度低溫12000g 離心15分鐘，棄上清，加入1mL 75%的乙醇清洗沉淀。7000g轉速離心5分鐘，去除上清溶液后開蓋風干，加入適當體積的RNase-free水溶解RNA。

測量所提RNA溶液A260nm、A280nm吸光值，計算A260nm/A280nm以衡量總RNA純度。

使用TAKARA公司的反轉錄試劑盒對RNA進行反轉錄。先使用gDNA Eraser酶在42攝氏度下消除所提RNA中混雜的基因組DNA。隨后使用反轉錄酶于37攝氏度將RAN反轉錄成cDNA。

1.3 原位雜交探針的制備

在NCBI網站上搜索BZR1基因的cDNA序列，找到特異性高的序列區段（400bp）左右，針對這一序列設計探針引物。然后以擬南芥花序cDNA為模板，擴增探針序列，用T4連接酶連接至pGEM-T載體（Promega公司），連接產物轉化大腸桿菌，使用氨芐抗性平板篩選陽性克隆，提質粒測序，測序結果正確者進一步進行質粒酶切（分別用Apa1酶和Spe1酶進行單酶切），酶切產物用SP6及T7轉錄酶分別進行轉錄，轉錄后的RNA產物經過純化后即為反義及正義探針。

1.4 石蠟切片的制備

用RNase Free的FAA固定液對Col-0花序進行固定，講過低溫抽真空后，花序材料完全浸透于固定液中，換新鮮的FAA固定液后4攝氏度低溫靜置過夜。用50%、60%、70%、80%、90%、95%及100%的梯度濃度的酒精進行材料脫水處理，再用25%、50%、75%及100%的二甲苯梯度濃度溶液進行透明化處理，逐步加入蠟片，直至材料完全置入100%純蠟中。包埋蠟塊，并用石蠟切片機進行花序組織的切片。

1.5 原位雜交實驗

對石蠟切片進行脫蠟覆水，在37攝氏度條件下用蛋白酶K對切片上的花序細胞組織的骨架蛋白進行消化，經過逐級脫水后每張片子加探針（50%甲酰胺，300mmoL/L NaCl，10mmoL/L Tris，1mmoL/L EDTA，1% Blocking Reagent），42攝氏度雜交過夜，次日依次用2×SSC溶液、0.5×SSC溶液、0.2×SSC溶液洗片，RNase消化30min，0.2×SSC溶液、PBS洗片，Blocking Reagent封閉1h，BSA封閉1h，抗-DIG-AP偶聯二抗2h，NBT-BCIP顯色，光鏡下待顯色程度合適后中止反應，封片觀察，拍片。

2 實驗結果

2.1 BZR1基因探針序列PCR

我們以擬南芥花序cDNA為模板，用正向引物（TCTAAGAACCCGAAACCGTT）和反向引物（TGTATCCTCTCTCCTTCCCAG）來對BZR1基因的特異序列進行PCR擴增。

PCR產物經電泳（圖1），以Trans 2k plus（全式金公司）DNA marker為指示，可見大小為600bp左右，與目的片段大小一致。

2.2 轉錄探針的檢測

用Roche公司的DIG轉錄試劑盒進行BZR1基因的探針轉錄，正反義探針經過電泳檢測，均顯示出明亮的RNA條帶（圖2），證明探針合成過程正常，可用于原位雜交實驗。

2.3 BZR1基因在花藥絨氈層及花粉母細胞中特異表達

為了進一步明確BZR1基因在花藥發育過程中的時空表達模式，本研究通過原位雜交的方法檢測了該基因在花藥4-12期的表達模式。

結果如圖3所示。

BZR1基因從花藥第5期開始在花粉母細胞和絨氈層中表達，信號持續至第8期開始減弱，隨著絨氈層的降解，信號逐漸減弱，最后完全消失。BZR1在花藥絨氈層及孢子母細胞中的表達模式暗示了其可能在花藥發育過程中發揮重要作用。

3 討論

原位雜交的結果顯示BZR1基因在花藥細胞中有表達，說明BZR1在其發育過程中可能發揮著重要的作用。BZR1基因表現出了較高的表達豐度，在花藥發育中、晚期（5-9期）顯示了一定的表達水平，且主要在絨氈層細胞中表達。絨氈層細胞對花藥的發育至關重要，因此我們可以推測BZR1基因可能主要通過參與調控花藥絨氈層細胞的發育來發揮其在雄性生殖方面的功能。

生命個體的遺傳信息經歷從DNA轉錄為RNA，再進一步翻譯成各種功能蛋白的過程，最后執行相應的生物學功能。僅mRNA水平的表達分析無法反映基因在翻譯水平的情況，因此，想要更多地了解BZR1基因參與雄性生殖過程的調控機制，在本研究的成果，還需要進行更為深入的蛋白質表達水平及功能分析。

參考文獻

[1]Bedinger， P.A.， Hardeman， K.J.， and Loukides， C.A. （1994）. Travelling in style： the cell biology of pollen[J]. Trends Cell Biol. （4）， 132-138.endprint

[2]Blackmore， S.， Wortley， A.H.， Skvarla， J.J.， and Rowley， J.R. （2007）. Pollen wall development in flowering plants. New Phytol[J]. （174）， 483-498.

[3]Goldberg， R.B.， Beals， T.P.， and Sanders， P.M. （1993）. Anther development： basic principles and practical applications[J]. Plant Cell （5）， 1217-1229.

[4]Sorensen， A.M.， Krber， S.， Unte， U.S.， Huijser， P.， Dekker， K.， and Saedler， H. （2003）. The Arabidopsis ABORTED MICROSPORES （AMS） gene encodes a MYC class transcription factor[J]. Plant J. （33）， 413-423.

[5]Ye， Q.， Zhu， W.， Li， L.， Zhang， S.， Yin， Y.， Ma， H.， and Wang， X. （2010b）. Brassinosteroids control male fertility by regulating the expression of key genes involved in Arabidopsis anther and pollen development[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA （107）， 6100-6105.

[6]Zhang， W.， Sun， Y.， Timofejeva， L.， Chen， C.， Grossniklaus， U.， and Ma， H. （2006）. Regulation of Arabidopsis tapetum development and function by DYSFUNCTIONAL TAPETUM1 （DYT1） encoding a putative bHLH transcription factor[J]. Development （133）， 3085-3095.

[7]Zhu， J.， Chen， H.， Li， H.， Gao， J.， Jiang， H.， Wang， C.， Guan， Y.， and Yang， Z. （2008）. Defective in Tapetal Development and Function 1 is essential for anther development and tapetal function for microspore maturation in Arabidopsis[J]. Plant J. （55）， 266-277.

[8]Zinkl， G.M.， Zwiebel， B.I.， Grier， D.G.， and Preuss， D. （1999）. Pollen-stigma adhesion in Arabidopsis： a species-specific interaction mediated by lipophilic molecules in the pollen exine[J]. Development （126）， 5431-5440.endprint