潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水微生物特性及機制

胡林潮　周新程　鄧文　陳萍　陳晶　張文藝

摘要：

為揭示潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水微生物特性及機制，以位于常州市城北污水處理廠內的潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水旁路試驗系統中的植物根系、濕地填料及濕地土壤中微生物為研究對象，通過鏡檢、脲酶、磷脂脂肪酸（PLFA）等分析手段對其進行相關研究。結果表明，植物根系、填料中含有團藻等菌膠團和輪蟲、變形蟲等原生動物，團藻等菌膠團通過自身新陳代謝及光合作用，利用尾水中N、P進行生物代謝，去除低碳源條件下尾水中的N、P等。濕地脲酶平均含量（N）約為22.43 mg/g，其活性與TN的去除呈線性相關，活性越高，TN去除率越高。消納城市污水廠尾水濕地填料中飽和脂肪酸（PLFA）含量為99.30%，不飽和脂肪酸含量僅為0.70%，這與潛流式人工濕地處理城市污水中的PLFA含量有很大差別（分別為76.97%、23.03%）。以脂肪酸生物標記量為指標，顯示濕地填料中形成了以好養細菌為優勢種群的微生物生態結構。團藻、好氧微生物是低碳源尾水中TN等污染物去除的主要載體微生物。

關鍵詞：尾水； 磷脂脂肪酸； 脲酶； 人工濕地

中圖分類號：X701

文獻標志碼：A文章編號：16744764（2016）06013507

Abstract：

The microorganisms of plant roots， wetland filler and wetland soil of subsurface flow wetland consumptive municipal sewage treatment plant effluents bypass test systems， in Changzhou City， north of the city sewage treatment plant， were studied through microscopic examination， urease， phospholipid fatty acid （PLFA） and other analytical tools for related seudies to reveal the characteristics and mechanism of microorganisms with Subsurface Flow Wetland consumptive municipal sewage treatment plant effluents. The results showed that plant roots， filler contained rotifers， amoeba and other protozoa and Volvox， Volvox used the N， P and other pollutant of tail waters through photosynthesis biological metabolism， removal of N、P， etc， under conditions of lowcarbon. The average content of wetland urease（N） was about 2243 mg/g， the activity of urease was linearly related to the removal of TN， the higher the activity， the higher the removal rate of TN. Saturated fatty acid （PLFA） content was 99.30%， unsaturated fatty acid content was only 0.70% in Wetland fillers， which with subsurface flow wetland treatment PLFA contents of municipal sewage is very different （76.97% and 23.03%， respectively）. The amount of fatty acid biomarker as an indicator， reveal wetlands matrix formed with aerobic bacteria was dominant structure of microbial ecology. Volvox， aerobic microorganisms was the main carriers of microbial removal of TN and other pollutants in low carbon source tail water.

Keywords：

sewage effluents； phospholipid fatty acid； urease； constructed wetland.

潛流式人工濕地生態消納城市污水廠尾水技術近年來在中國南方地區一些污水處理廠提標改造中得到應用，該技術主要通過濕地基質、濕地植物、微生物的協同作用對污水廠尾水進行消納[14]。由于城市污水廠尾水碳含量低，總氮及硝酸鹽氮含量較高，C、N、P營養比約為54∶17∶1，難以達到傳統生物法處理城市污水微生物所需C、N、P營養比100∶5∶1。這種基于濕地填料多因素協同作用下的尾水生態消納，其微生物特性與傳統潛流式人工濕地處理城市污水可能存在差異。有關濕地土壤層微生物特性的研究已有報道，崔偉等[5]通過對濕地脲酶活性的測定有可能建立衡量濕地去除效果的模式體系，且得出濕地脲酶活性與TN去除率呈正相關性；SanzCobena等[6]研究表明土壤有機氮轉化為無機氮的強度可用脲酶活性來反映，脲酶活性是評價氮素轉化機制的指標之一；王震宇等[7]通過DAPI染色法、FDA染色法和稀釋平板法發現黃河三角洲退化濕地微生物數量、活性及多樣性與土壤鹽度呈顯著負相關；Richard等[8]通過PLFA譜圖研究發現真菌在低肥力的土壤生化過程中發揮重要作用。endprint

潛流式人工濕地主要通過濕地微生物消納城市污水廠尾水，對尾水有一定的脫氮除磷效果，在中國已有應用[9]，但在低碳源條件下對濕地微生物的研究報道相對較少。本研究以潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水為試驗研究對象，通過鏡檢濕地介質（填料、底泥土壤、植物根系等）中的生物膜，檢測濕地土壤脲酶活性和磷脂脂肪酸（PLFA）指標，揭示低碳源、高總氮、高硝酸鹽氮條件下潛流式人工濕地微生物功能、活性、多樣性和群落結構等方面特性。

1材料與方法

1.1尾水消納旁路試驗系統及其運行效果

試驗地點為江蘇省常州市城北污水處理廠內，如圖1所示。

人工濕地剖面如圖2所示。濕地呈長方體結構，寬（B）2.0 m，總長（L）8.0 m，深（H）1.5 m。其中進水池長（L1）0.5 m，調節池長（L2）0.5 m，人工濕地主體長（L3）6.0 m，沉淀池長（L4）0.5 m，集水池長（L5）0.5 m，孔隙率40%，有效容積9.6 m3，日處理水量為5～8 m3，水力負荷0.31～0.50 m3/（m2·d）。尾水依次流過濕地進水池、調節池、濕地主體，最后進入收集池，通過管道輸送至尾水排放口。通過流量計和調節閥門控制進水流量.濕地內部采用石灰石、鋼渣、陶粒、紅磚作為濕地填料，充填高度1.2 m，填料上部鋪設無紡布，再在無紡布上層鋪0.25 m厚土壤，種植黃花鳶尾、菖蒲、美人蕉、梭魚草等挺水植物，無紡布可以阻斷土壤下滲到濕地填料中堵塞濕地，同時，無紡布具有透水性，不會阻斷水流，植物的根系也可以穿透無紡布向下伸展。

1.2樣品采集

1）微生物鏡檢樣品的采集，使用滅菌后的玻璃采樣儀器，用鑷子和小刀刮取濕地介質填料和植物根系表面的生物膜，制作載玻片，并立即分析。

2）中試濕地土壤的采集：1）中試脲酶活性土壤的樣品采集，從2014年7—11月之間每月采集一次，土壤采集深度20 cm，分別采集濕地前端、中部、后端的土壤樣品，樣品前端、中部、后端分別平行設置3個點，分析土壤為3個采集點的混合土壤，土壤采集后，自然風干；2）中試濕地磷脂脂肪酸土壤的樣品采集，于2014年11月份采集，采集深度為20 cm，濕地中均勻設置前中后3個采集點，分析樣品為3個采集點的混合樣品。土壤采集后冷凍于-20 ℃冰箱，分析測定時取用。

1.3檢測方法

1.3.1微生物鏡檢

生物相鏡檢采用XDS200PH倒置生物顯微鏡觀測，生物相識別參考《環境微生物圖譜》[10]。

1.3.2土壤脲酶活性檢測

濕地土壤的脲酶活性采用奈氏比色法測定[1112]，具體方法為：稱取5 g風干后的土壤樣品，放置于100 L錐形瓶中。加入10 mL pH 6.7的磷酸緩沖液和0.5 mL甲苯，搖勻，混合處理15 min.再加入10 mL 10%尿素溶液（對照以水代替），置于37℃恒溫培養箱培養48 h。培養結束后，加入20 mL的 1 mol/L KCl，震蕩搖勻10 min。將混合液通過濾紙過濾，吸取0.1 mL濾液置于25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至10 mL，搖勻，加入4 mL 的1 mol/L NaOH，顯色，稀釋至25 mL刻度處。靜置10 min，以空白樣品作對照，在波長460 nm處測定其吸光度。

1.3.3磷脂脂肪酸的測定

磷脂脂肪酸（PLFA）測定，參照Bligh法[1314]以及本課題組論文 [15]，主要測試步驟為：①脂肪酸的提取；②PLFA的分離；③PLFA的甲酯化；④PLFA樣品的提取和測定。待測樣品用GSMSQP2010氣相色譜質譜聯用儀分析，色譜柱為DB5MS（30 m × 250 μm × 0.25 μm）毛細管柱，氦氣作為載氣，不分流進樣，掃描方式：SIM。

2結果與討論

2.1濕地微生物鏡檢

采用倒置生物顯微鏡對濕地植物根系和濕地填料進行鏡檢，結果如圖3所示。其中，（a）是濕地植物根系在倒置顯微鏡下拍攝出的圖片，可以看出植物根系有生物膜菌膠團等少量微生物附著在其表面。（b）為濕地出水口處土壤中鏡檢出的團藻。（c）、（d）是濕地填料上鏡檢出的微生物，分別為輪蟲和變形蟲等原生動物。人工濕地植物根系具有泌氧作用，有較多好氧微生物附著在植物根系上，同時，填料表面也是微生物附著的地方，由于填料比表面積較大，填料和植物根系能夠截留尾水中的污染物，微生物以這些污染物為食，并同化為自身的一部分，從而降解尾水中的污染物。同時，濕地出水口處發現有團藻，說明在低碳源條件下，團藻通過光合作用，利用尾水中的N、P等污染物進行生物代謝，從而實現低碳源條件下對尾水中N、P的去除。

2.2濕地土壤脲酶活性

脲酶是濕地土壤中氮轉換的關鍵酶，其作為一種生物催化劑，能促進尾水中含氮有機物的分解，同時，脲酶活性可作為濕地對含氮有機污染物凈化能力的衡量指標[16]。表2為2014年7—11月濕地前、中、后端土壤脲酶活性變化情況。從月變化看，濕地脲酶含量從7—10月一直處于增長狀態，到10月達到最大，平均脲酶含量（N）為3701 mg/g，11月有所下降。其中，濕地前端、中部、后端的脲酶含量（N）平均值分別是22.15、24.79 和20.35 mg/g。由于尾水碳含量低，總氮及硝酸鹽氮含量較高，C、N、P營養比難以達到傳統生物法處理城市污水微生物所需營養比條件，導致濕地脲酶活性平均含量（N）為22.43 mg/g，與吳振斌等[17]研究人工濕地植物根區土壤酶活性與污水凈化效果及其相關分析所測得的脲酶活性（N）平均值260 mg/g存在較大差異。

濕地前端和中部的平均脲酶含量高于濕地后端的平均脲酶含量，即濕地前端和中部的脲酶活性高于濕地后端的脲酶活性，脲酶活性大體上沿程下降。濕地系統中氮素和有機質污染物在沿程中被降解，沿著水流方向慢慢減少，從而導致微生物的數量、活性、多樣性等降低，脲酶活性也隨之降低。這與黃娟等[18]關于潛流式人工濕地土壤中、上層脲酶活性高于土壤下層脲酶活性的研究結果有一定不同。endprint

從圖4中可以看出，人工濕地在生態消納城市污水廠尾水過程中，濕地土壤脲酶活性與TN去除率之間呈正相關性。脲酶能夠作為濕地消納尾水效能的一個重要指標，濕地土壤脲酶活性越高，越有利于濕地微生物的代謝、繁殖，濕地對TN的去除效果越好。其擬合動力學方程式為

y=3.344 9x-69.337

R2=0.756 5，n=5，P=0.055 3

式中：y為濕地土壤脲酶（N）活性，mg/g；x為TN去除率，%；R2為決定系數，無量綱，其值越接近1，表明擬合效果越好；P為顯著性差異，無量綱；當P<0.05，表明相關性顯著，P<0.01，表明相關性極顯著；n為樣本數。

這與鄧風等[19]研究發現潛流濕地土壤脲酶活性與TN的去除率之間存在顯著正相關這一結果存在差異。可能由于城市污水廠尾水中TN含量遠遠低于城市污水中TN含量，導致消納尾水濕地土壤脲酶活性與TN去除率之間相關性不顯著。

2.3濕地土壤PLFA

對濕地土壤中提取的PLFA的GCMS圖譜進行分析如下（見表3），表3列出了濕地土壤中的脂肪酸所標記的微生物及其生物標記量等。共檢測出3種磷脂脂肪酸，且濕地土壤中微生物均為細菌，且好氧細菌占絕大部分并有部分放線菌。其中不飽和脂肪酸9Me19：0在濕地土壤中含量為0.054 nmol/g，含量最少；其次是飽和脂肪酸i18：0，其含量為0271 nmol/g；最多是飽和脂肪酸17：0，其含量為0.508 nmol/g。根據White等[2026]研究得出PLFA量和生物量之間存在的轉換系數，取4×104 cell·pmol-1推算出飽和脂肪酸17：0的生物標記量為20.32×106 cell/g，指示微生物為好氧細菌；飽和脂肪酸i18：0和不飽和脂肪酸9Me19：0的生物標記量分別為0.22×106 cell/g和10.84×106 cell/g，指示微生物都為放線菌。由此可知，運用人工濕地生態消納城市污水廠尾水，使得濕地土壤中形成了以好氧細菌為優勢種群的微生物生態結構。

運用PLFA法檢測尾水消納濕地填料底泥，檢測出的脂肪酸種類相對較少、不飽和脂肪酸含量占極少部分以及未檢測出真菌、假單胞桿菌、嗜熱解氫桿菌等存在，這與尹勇等[15]運用PLFA法研究生態強化法原位凈化村鎮污水微生物特性的結果存在明顯差異。這可能是由于城市污水廠尾水中碳含量低，總氮及硝酸鹽氮含量較高，C、N、P營養比難以達到傳統生物法處理城市污水微生物所需營養比條件，導致微生物特性與傳統潛流式人工濕地處理城市污水存在以上差異。

2.4低碳源條件下的尾水人工濕地消納微生物作用機制

低碳源條件下，人工濕地對尾水中的污染物降解主要基于以下3種途徑：

1）由于嗜磷菌在溶解氧小于2 mg/L的情況下將會釋放，所以污水處理廠尾水的DO大多為2.0～4.0 mg/L。當低碳源的尾水進入潛流濕地時（HRT=20～24 h），除本身含有一定濃度氧外，濕地植物根區根系具有泌氧作用，因此，潛流濕地是一個以好氧環境為主的微生態系統。濕地填料表面及濕地植物根系表面及周圍形成了以好氧微生物為主的氧化區域，尾水中有機污染物被好氧微生物利用、降解和分解。

2）具有一定比表面積的石灰石、鋼渣、陶粒、紅磚構成的濕地填料及其表面生長的微生物膜，通過截留、過濾、吸附等過程消減尾水中的污染物和SS，表現出水COD、TN、TP、氨氮及SS的同步降低。尾水中COD含量低、總氮及硝酸鹽氮含量較高，氮主要通過濕地填料表面的微生物膜硝化和反硝化作用以及氨的揮發等過程被去除，濕地填料間隙和植物根系之間能夠形成多個好氧—厭氧微區域，濕地微生物能夠利用這些微區域對尾水中的氮進行硝化和反硝化作用，從而降解、轉化尾水中的氮素。尾水中磷的去除途徑是通過微生物對磷的同化吸收以及自然沉降、填料吸附等，由于濕地植物的光合作用和呼吸作用的進行，交替出現了好氧和厭氧環境，使得微生物對磷的同化作用更易進行。

3）由于濕地系統是一個有氧生態系統，其中生長有一定數量的藻類微生物，其對濕地系統的脫氮、除磷也有一定的貢獻。藻類微生物（如團藻）可能通過光合作用或自身新陳代謝作用，利用尾水中的N、P等污染物進行生物代謝，從而實現低碳源條件下對尾水中N、P的去除。

3結論

潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水的濕地系統是好氧生態系統，PLFA揭示該系統中形成了以好氧細菌為優勢種群的微生物生態結構。濕地填料和植物根系表面生物膜及懸浮團藻，能同化植物根系和濕地填料截留下的污染物質，降解尾水中的污染物；低碳源條件下，團藻、好氧微生物是低碳源尾水中TN等污染物去除的主要載體微生物；濕地脲酶活性與TN的去除呈線性相關，活性越高，TN去除率越高；一定的溶解氧濃度水平和脲酶活性是濕地消納尾水調試及運行重要控制指標。本研究對潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水微生物特性及機制的研究有著重要的意義。

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（編輯郭飛）endprint