PLK1抑制劑Volasertib靶向治療腫瘤的研究進展

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(南華大學醫學院腫瘤研究所；腫瘤細胞與分子病理學湖南省重點實驗室,湖南 衡陽 421001)

腫瘤分子靶向治療是在腫瘤分子生物學的基礎上，以腫瘤組織或細胞相關的特異性分子作靶點，使用能與這些靶分子特異結合的抗體、配體等靶標分子特異性抑制劑或藥物達到直接治療或導向治療目的的一類治療方法。靶向有絲分裂是腫瘤分子靶向治療方法的一種。多種靶向有絲分裂的藥物已被用于臨床，且已被證實在臨床上具有明顯的抗腫瘤活性，例如傳統的微管蛋白結合劑紫杉烷類和長春堿類藥物。然而，傳統的微管蛋白結合劑抗腫瘤藥物因缺乏特異性，均會導致各種不良反應，例如神經毒性等。因此越來越多的研究聚焦于集中開發更具特異性的新型抗腫瘤藥物。PLK1(polo-like kinase1)是一種絲/蘇氨酸激酶，在有絲分裂過程中起重要調節作用，目前已成為一個備受人們關注的腫瘤治療靶點。volasertib是目前最具特色的ATP競爭性PLK1小分子抑制劑。不論是單藥治療還是聯合治療，volasertib在多種臨床前/臨床研究模型中均表現有明顯的抗腫瘤作用。本文主要探討volasertib靶向治療腫瘤的研究進展。

1 PLK1

PLK1(polo-like kinase1)是首個被發現的Polo激酶，并通過作用于不同的特異性底物來調節幾種有絲分裂事件：包括(1)磷酸化激活Cdc25c和CyclinB1/Cdk1復合物促進有絲分裂啟動；(2)調節微管成核促進有絲分裂進展；(3)促進中心體成熟以及紡錘體兩極分配；(4)調控胞質分裂；(5)調控后期促進復合物APC/C促進有絲分裂退出。與其在有絲分裂中不同的功能相一致，PLK1具有多種定位。間期，PLK1定位在細胞質、微管和中心體上。有絲分裂和胞質分裂期則集中在著絲粒、微管及中心紡錘體上。PLK1還參與DNA復制和染色體/微管動力學過程。此外，PLK1也參與DNA損傷應答反應過程[1]，包括DNA檢查點的激活、維持以及損傷恢復。PLK1也已被證實在廣泛的惡性腫瘤中過表達，包括非小細胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌和彌漫性大B細胞性淋巴瘤等。同時，PLK1過表達與許多惡性腫瘤(包括NSCLC，結腸癌和肝母細胞瘤)的預后相關，因此推動了PLK1小分子抑制劑的發展。

2 PLK1抑制劑

目前主要有兩類PLK1小分子抑制劑。第一類是靶向PLK1 KD(kinase domain)的小分子抑制劑。KD，即PLKs的N端上的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域，它與底物空間上接鄰并催化底物磷酸化，且具有特定的作用靶點—ATP結合域。ATP結合域是蛋白激酶催化區域上的一段高度保守區域。這類PLK1小分子抑制劑的作用機制是結合PLK1上的ATP結合域，從而抑制PLK1的活性。近年來針對PLK1 KD的小分子抑制劑的研究已取得顯著成果，多數是ATP競爭性抑制劑，且部分藥物已經進入臨床研究階段并顯示出抗腫瘤活性。其中具代表性的藥物是BI2536與volasertib(BI6727)。BI2536是一種二氫蝶啶酮類化合物，許多臨床前研究中表明BI2536具有抗腫瘤活性，然而后續臨床研究發現其療效差，且存在許多嚴重的不良反應。因此，人們研發了第二代二氫蝶啶酮類的PLK1小分子抑制劑volasertib (BI6727)。Volasertib與BI2536具有相同的有效性和特異性，但較后者它適用安全范圍更廣，且毒副作用小。因此，volasertib是目前最具特色的ATP競爭性PLK1小分子抑制劑。PLK1 KD小分子抑制劑中還有另一種類型：即ATP非競爭性抑制劑。這類抑制劑主要結合于PLK1待磷酸化的底物結合位點，具有對PLK1的底物依賴性和ATP非競爭性的特點。此類小分子化合物主要為芐苯乙烯砜類和均二苯乙烯類化合物。其中具有代表性的藥物為ON01910。ON01910是一種水溶性的芐苯乙烯砜類似物，在小鼠腫瘤異種移植模型中具有抗腫瘤活性，具體作用機制不清楚，目前處于I期臨床研究階段。最新研究[2]表明ON01910對PLK1的抑制作用很弱，且同時交叉抑制多種激酶。因此對ON01910仍需進一步探索研究。目前靶向PLK1 KD的小分子抑制劑在臨床研究的主要問題是劑量限制性毒性作用，這是由于抑制劑的特異性低所導致的。多數PLK1抑制劑可同時交叉抑制其它蛋白激酶，因此研發PLK1特異性的抑制劑成為關鍵。

第二類是靶向PLK1 PBD(Polo-box domain)的小分子抑制劑。PBD，即PLKs的C端上的特征性結構域，它參與調節PLK1的亞細胞器定位并增強KD對底物的磷酸化作用。PBD上含有1個由多種關鍵性氨基酸殘基組成的袋狀結構，此結構可與磷酸肽結合從而介導磷酸化反應，這一過程可被特異性靶向抑制，這表明PBD可成為PLK1的另一靶點。除此之外，PLKs家族是唯一含有PBD特殊結構的激酶，且PLK1-4激酶含有的PBD與各自不同的底物高度特異性結合，這說明PBD可代替KD成為PLK1高度特異性的靶點。這類小分子抑制劑目前有poloxin(PXN)、百里香琨(thymoquinone)、紅倍酚( purpurogallin，PPG) 和poloxipan(PXP)。這類抑制劑可通過阻止PLK1與底物結合以及干擾PLK1亞細胞器定位來抑制PLK1活性，從而表現出抗腫瘤活性。有研究發現此類抑制劑僅僅抑制PLK1活性，對PLKs其他成員并無抑制作用。盡管PBD靶向藥物特異性強，已成為新型PLK1抑制劑，但此類小分子抑制劑與PBD的結合水平仍較低，因此未來需研發具有高效細胞攝取率和高度穩定性的PLK1 PBD特異抑制劑。

3 Volasertib的分子結構與特點

volasertib是第二代二氫蝶啶酮類的衍生物,是目前最受矚目的ATP競爭性PLK1小分子抑制劑。它通過兩個氫鍵結合PLK1激酶結構域(ATP)的NH2末端和COOH末端鉸鏈區-ATP口袋，從而導致PLK1激酶失活。volasertib的有效性和特異性和BI2536相同。但較后者，volasertib具有良好的藥理學特征，即高分布性和良好的組織滲透性，因此毒性作用小、不良反應少。然而由于細胞內存在大量蛋白激酶，且ATP結合域是一段高度保守序列，導致volasertib與多數ATP競爭性抑制劑相同可同時交叉抑制其它蛋白激酶。此外，相較于其前身BI2536，volasertib改善并提高了藥物動力學，延長了與腫瘤接觸的時間，提高了生物利用率，并具有高組織分布性和較長半衰期等特點。魯道夫等[3]發現volasertib在抑制PLK1的同時還可抑制PLK2和PLK3，IC50值分別為0.87 nmol/L、5 nmol/L和56 nmol/L。 PLK2和PLK3有抑制腫瘤生長的作用，因此volasertib對PLK2和PLK3的藥理抑制作用可能會使它們在細胞內的抗腫瘤活性降低或喪失。然而多項試驗結果表明，當volasertib濃度升至10 μmol/L時，其對50種不同功能的蛋白激酶的活性并無明顯的抑制作用。同時,不論是單藥治療還是聯合治療， volasertib在大量臨床前研究中都表現對多種人類惡性腫瘤有明顯的抗腫瘤活性，這使得PLK1成為治療多種人類惡性腫瘤的一個熱門靶點。最近，食品藥品監督管理局(FDA)授予volasertib為抗腫瘤藥物的一項重大突破，并批準volasertib可作為PLK1小分子抑制劑抗腫瘤藥物在臨床上治療急性髓性白血病(AML)患者[4]。因此，volasertib是目前最具特色且最成功的ATP競爭性PLK1小分子抑制劑。

4 Volasertib的抗腫瘤機制

Volasertib的抗腫瘤分子機制主要是抑制PLK1表達從而發揮抗腫瘤活性的作用。PLK1表達下調可調控多種蛋白水平發生變化。Volasertib可通過抑制PLK1的表達，進一步下調促癌基因(Ras、C-myc和HIF)的表達和上調抑癌基因(p53和PTEN)的表達，導致抑制腫瘤細胞生長增殖、并誘導腫瘤細胞凋亡。其中，PLK1和p53可相互負相調節，且關系最為復雜緊密。一方面，PLK1可直接與p53結合，抑制p53的轉錄激活和p53的促凋亡作用；另一方面，PLK1可通過磷酸化MDM2和拓撲異構酶I結合蛋白(Topors)以及激活Cdc25C酶，進而間接抑制p53的轉錄激活，并增強了p53的降解[5]。因此，volasertib可通過抑制PLK1的表達進而上調p53的表達，從而影響下游相關靶基因的表達來抑制腫瘤細胞增殖。Volasertib還可通過抑制PLK1活性來下調β-整合素表達，進而抑制腫瘤細胞侵襲與轉移。有研究人員[6]通過軟瓊脂集落形成試驗發現了volasertib能夠消除細胞自我更新的能力。Volasertib[7]可通過抑制含溴基結構域的BDR4蛋白的活性，從而下調MYC的表達，進一步抑制腫瘤細胞增殖。Fingas等[8]發現volasertib通過抑制細胞內Mcl-1蛋白表達從而誘導細胞凋亡。Cholewa等[9]發現volasertib可上調腫瘤細胞內異質性核糖核蛋白(hnRNPC)的表達，進而抑制極光激酶B，最終導致腫瘤細胞微核化凋亡。盡管volasertib與細胞內代謝途徑之間的聯系仍不清楚，但有研究發現volasertib可下調乳酸脫氫酶A、乳酸脫氫酶B(LDH-A和LDH-B)以及磷酸己糖異構酶(GPI)的表達，進而影響腫瘤細胞糖酵解代謝途徑。

5 Volasertib的臨床前研究

5.1單藥治療Volasertib可抑制多種腫瘤細胞系細胞增殖，包括人結腸癌細胞、肺癌細胞、黑色素瘤細胞和非霍奇金淋巴瘤細胞等，且volasertib對腫瘤細胞的抑制作用隨著其藥物濃度提升和作用時間延長而增強。研究人員在小鼠結腸癌(HCT116)移植模型上注射單劑量為35 mg/kg的 volasertib后，發現從小鼠的腫瘤組織、多個器官及血漿樣品中提取的藥物濃度都很高。體內實驗顯示，不論采用靜脈注射或口服的治療方式，volasertib在人結腸癌和肺癌移植小鼠模型上都表現出很強的抗腫瘤作用和良好的耐受性。免疫組化分析顯示：在上述2種腫瘤移植模型中，本品在抑制腫瘤生長的同時，也致使腫瘤細胞有絲分裂指數和凋亡率升高。盡管volasertib在小鼠體內耐受性良好，但Trakala等[10]人發現人體內PLK1過度缺乏會阻止巨核細胞多倍體化，從而導致體內巨核細胞成熟障礙和嚴重的血小板減少癥。這些結果與volasertib在臨床試驗中產生的不良結果一致。因此為了降低它的臨床毒性，故對其作用于細胞周期的機制仍需進一步研究。

5.2聯合治療有體外實驗表明volasertib能增強順鉑和甲氨蝶呤抑制人骨肉瘤(HOS)細胞增殖的效應，且volasertib和長春堿、多柔比星之間也具有協同抗癌作用。Weiss等[11]發現volasertib和長春新堿可協同誘導尤文肉瘤(ES)細胞凋亡，兩者聯合治療的腫瘤細胞中可檢測到Bcl-2高磷酸化、Mcl-1表達水平下調，從而激活促凋亡蛋白BAX和BAK的表達，導致caspase激活和線粒體膜電位喪失，最后誘導細胞凋亡。Hong等[12]發現volasertib和sepantronium (靶向survivin的蛋白)在非小細胞肺癌細胞中有協同抗癌作用。此外，Volasertib聯合化療、放療和靶向制劑在不同的腫瘤異種移植模型中都已被證實有協同抗癌作用。Volasertib聯合阿糖胞苷治療的抗癌療效在AML患者皮膚來源的腫瘤細胞小鼠移植模型(AML-6252)上明顯增強，且藥物毒性作用降低[13]。Abbou等[14]發現在人類橫紋肌肉瘤小鼠移植模型中，volasertib和長春新堿聯合治療較單藥治療可顯著降低腫瘤體積。此外，在鱗狀細胞癌(SCC)移植模型上，volasertib可通過誘導腫瘤細胞阻滯在細胞周期，增強放療的抗癌作用。因此，volasertib在組合治療方案中有廣闊前景。

5.3藥物耐受性Volasertib在紫杉烷類和長春堿類耐藥的腫瘤細胞以及表達多重耐藥(MDR1)基因的黑素瘤細胞細胞中仍具有抗腫瘤活性。MDR的產生與轉運蛋白如ABC-B1、ABC-C1和ABC-G2主動外排藥物有關。在轉運蛋白過表達的耐藥細胞中可觀察到volasertib和靶向轉運蛋白的抗癌藥物具有協同作用，表明volasertib可逆轉這些轉運蛋白的MDR活性。流式細胞實驗結果表明PLK1抑制劑通過抑制轉運蛋白的流出，導致靶向轉運蛋白的抗癌藥物在細胞內累積并發揮作用。有研究發現volasertib通過抑制ATP水解來逆轉ABC-B1介導的MDR，且volasertib也可作為ABC-G2轉運蛋白的競爭性抑制底物。此外，Bhola等[15]發現PLK1在雌激素受體α陽性(ER +)乳腺癌中起關鍵作用，volasertib抑制PLK1表達可消除雌激素非依賴性的ER轉錄活性和降低ER蛋白水平，從而抑制激素非依賴性(ER +)MCF7和HCC1428乳腺癌細胞生長。綜上所述，volasertib耐受性比一些傳統抗癌藥物要好，且具有一定的臨床應用價值，從而使它在臨床上得到廣泛地應用。

6 Volasertib的臨床研究

6.1單藥治療在一項劑量遞增的I期臨床試驗中，65名晚期或轉移性實體瘤患者每三周1次接受volasertib 12-450 mg的1 h靜脈注射，結果，有3名受試者(5%)達到部分緩解(PR)，26名受試者(40%)病情穩定，2名受試者無明顯反應，在受試的晚期膀胱上皮癌、卵巢癌和黑色素瘤患者中，有31名(48%)達到PR和病情穩定，并有6人無進展生存期(PFS)超過6個月，其中2人的PFS分別達403和550天；受試者常發生的不良反應包括貧血(22%)、中性粒細胞減少(15%)、血小板減少(14例%)、疲勞(15%)、惡心(9%)和脫發(9%)，不良反應均可逆[16]。在一項II期臨床試驗中，50名晚期膀胱上皮癌重癥患者每三周1次接受volasertib 300mg的1h靜脈注射，結果，7名受試者(14%)達到PR，13名受試者(26%)病情穩定，受試者對藥物反應時間平均為41周，PFS平均為6.1周，尤其，16名受試者(32%)PFS超過90天，10名受試者(20%)PFS甚至超過180天；受試者常發生的不良反應為中性粒細胞減少(28%)、血小板減少癥(20%)和貧血(16%)，不良反應均可逆[8]。

6.2聯合治療在一項I期臨床試驗中，30名晚期或轉移性實體瘤患者每三周1次接受volasertib 100～300 mg和順鉑60～100 mg/m2的1h靜脈注射，結果，有2名受試者(6.7%)達到PR，11名受試者(36.7%)病情穩定，受試者PFS平均為93.5天[17]；受試者主要的不良反應是血小板減少、中性粒細胞減少和疲勞。在一項I/IIa期臨床試驗中，復發性或頑固性急性髓細胞白血病(AML)患者分組接受volasertib(150、250、300和400 mg，每28天的第1天和第15天各一次，1h靜脈注射)單用或與低劑量阿糖胞苷(20 mg，每天兩次)聯用，結果，volasertib單用的低劑量(150和200 mg)組13名受試者4人病情穩定，而高劑量(300和400 mg)組16名受試者有4人達到完全緩解(CR)，5人血象短暫性穩定；單藥治療組29名受試者有8人出現不良反應，包括貧血、血小板減少、鼻出血以及疲勞；聯用組32名受試者中有7人達到完全緩解(CR)，2人達到PR，6人血象基本穩定[18]。在一項劑量遞增的I期臨床試驗中，具有晚期實體腫瘤患者分組接受volasertib(150～350 mg，每三周1次，1h靜脈注射)和阿法替尼或尼達尼布聯用，結果，本品與阿法替尼聯用組中兩名受試者達到PR，1名為非小細胞肺癌患者，1名為舌鱗狀細胞癌患者；本品與尼達尼布聯用組中1名乳癌患者達到CR，PFS為447天，1名非小細胞肺癌患者達到PR，PFS為267天[19]。

7 展 望

Volasertib作為目前最具特色的PLK1小分子抑制劑，它的出現對人類惡性腫瘤的治療是一個重大突破。然而，volasertib在臨床應用上仍存在一些血液系統的不良反應，這與volasertib作用于PLKs家族特有結構ATP結合域有關。有研究表明PLK1-PLK4 ATP 結合域的結構體系彼此相似，但又各自含有其特有的氨基酸殘基，其中F58和R134為PLK1 ATP結合域所特有，那么是否可以利用PLK1與特異性氨基酸殘基的相互作用進而提高volasertib的特異性。還有研究報道[20]納米載體可增強藥物特異性，實現個體的精準治療，那么是否可以利用納米載體來運輸volasertib進而降低它的不良反應。這些都有待于臨床前及臨床研究探索解決。盡管如此，volasertib相較于傳統抗癌藥物，其毒性作用小、不良反應少。許多高齡或無法耐受標準化療的重癥患者可考慮進行PLK1抑制治療作為替代治療策略。并且，volasertib已經作為單一或聯合抗癌藥物被批準上市，主要用于治療AML患者。因此，volasertib是一種很有潛力的新型抗腫瘤藥物，以上對volasertib臨床前及臨床的研究為治療人類惡性腫瘤提供了依據。

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(本文編輯：蔣湘蓮)