環狀RNA在膠質瘤中的研究進展

朱 磊，董 倫，張恒柱 （大連醫科大學，遼寧 大連 6044；江蘇省蘇北人民醫院神經外科，江蘇 揚州 500）

0 引言

膠質瘤約占原發性中樞神經系統腫瘤的40%～60%［1］，是中樞神經系統最常見的腫瘤，世界衛生組織（WHO）根據腫瘤的細胞和組織學特點，將其分為Ⅰ～Ⅳ級。膠質瘤可發生于中樞神經系統的任何部位和任何年齡，平均存活期僅為14個月［1］，其中膠質母細胞瘤惡性程度最高，預后最差，95%未經治療的患者生存期不超過3個月。膠質瘤的發生發展涉及細胞周期與信號傳導通路、基因表達等多方面內容的改變。因此，研究膠質瘤，尤其是膠質母細胞瘤的相關分子機制，探索新的、安全有效的診療方法具有重要意義。

環狀RNA（circRNA）是近年來發現的一種特殊類型的RNA，是指3′端與5′端共價結合形成的閉合單鏈環狀RNA，由Sanger等［2］于1976年在類病毒研究中發現，并首次提出此概念。由于早期普遍認為circRNA是基因表達中的副產物，因此關于環狀RNA的研究也停滯不前。近年來，隨著分子生物學及分子測序技術的迅猛發展，環狀RNA的潛在特性和功能逐漸被發現。有研究［3］指出，環狀RNA在神經系統中含量豐富，呈現動態表達的特點，而且可能參與了膠質瘤的增殖、轉移等多個生物學過程［4］，有望成為膠質瘤的新型診斷標志物，并為治療提供新的思路和方向。本文主要介紹環狀RNA的形成、特點及功能，并討論在膠質瘤中的作用。

1 環狀RNA的產生、特點和功能

1.1 環狀RNA的產生環狀RNA的具體產生機制尚未明確，根據前體序列的來源可分為外顯子形成的環狀 RNA［4］、內含子形成的環狀 RNA［5］、外顯子和內含子共同組成的環狀 RNA［6］及 tRNA前體形成的環狀RNA［7］。 ①外顯子來源的環狀 RNA（exo circRNA），其形成主要有直接反式剪接（或稱內含子配對驅動環化）和外顯子跳讀（套鎖驅動環化）兩種機制，過程復雜，需ALU重復序列等多種因子參與。前者是一個外顯子的3′端剪接供體與上游的5′端剪接受體結合，切除內含子，然后形成環狀 RNA［4］；后者是內含子之間配對形成環狀套鎖，再剪切其中的內含子，最后形成環狀RNA［8］。②內含子來源的環狀RNA（ciRNA），形成依賴于外源性鳥苷（exoG）、5′端剪接區域7 nt長的富含GU的序列及靠近分支部位的11 nt的富含C的序列，此類環狀RNA較為少見，但具有轉錄調節的作用［5］。③外顯子和內含子共同組成的環狀RNA（EIciRNAs），通過直接反向剪接形成，內含子不被剪切，保留其中。這類EIciRNAs只存在于細胞核中，能夠促進親本基因的轉錄［6］。④tRNA前體形成的環狀 RNA（tricRNA），如tric31905，其形成需要保守的tRNA及加工酶的參與，但具體的機制及功能尚未明確［7］。

1.2 環狀RNA的特點①分布廣泛，含量豐富。據報道，環狀RNA廣泛分布在原核和真核細胞中，從病毒、果蠅到人類細胞都有環狀RNA的存在［3］；10%以上人類基因可以轉錄生成環狀 RNA［9］，You 等［10］指出，腦組織中約20%的編碼蛋白的基因可以產生環狀RNA。②結構穩定，半衰期長。環狀RNA無5′帽結構和3′-PolyA尾結構，對RNA核酸外切酶和脫支酶有一定抵抗性［11］，大多數環狀 RNA半衰期超過48 h［12］，比線性 RNA 半衰期（約 10 h）長［13］，然而環狀RNA核酸內切酶可使內含子來源的環狀RNA水解，其半衰期（小于 15 s）較短［14］。 ③高度保守，表達特異。共價閉合環狀結構使環狀RNA穩定性好，導致保守性高，而且序列長度在進化中也高度保守［3］；You等［10］指出環狀RNA首尾相接處的外顯子更具有高度的保守性。環狀RNA的表達具有時間和空間特異性，Rybak-Wolf等［3］在實驗中證實，相對其他組織，環狀 RNA（如 circRims2、circTulp4、circPhf21a等）不僅在人和鼠等哺乳類動物腦組織中表達豐富，甚至在果蠅中也是這樣。另外，環狀RNA表達具有組織特性，其中嗅球、前額葉皮質、海馬、小腦等高表達特定種類的環狀RNA；在神經元的不同部位，環狀RNA的含量也不相同，突觸中的豐富度最高，這可能與皮質中突觸密度高、ALU重復序列多等有關。環狀RNA表達也具有分化發育階段的特異性，其增多通常伴隨著宿主轉錄的上調，當然也有例外，比如環狀RNAZfp609（circZfp609）在神經元分化過程中持續定量表達，這提示環狀RNA在腦組織分化發育中可能具有重要作用。除此之外，環狀RNA在肺、胰腺、膀胱、胃、直腸等組織中均有表達，而且可以隨著組織器官的發育而表達，如心臟中的NCXI就隨著發育的不同階段被誘導表達［15］。

1.3 環狀RNA的功能（1）海綿作用。①miRNA的海綿作用［16］。miRNA是一類長度約21 nt，與mRNA靶向結合的 RNA［17］。環狀 RNA具有與 miRNA結合位點，起到抑制其對應miRNA的降解作用。如小腦退化相關蛋白1反義轉錄物（CDR1as／ciRS-7）在小腦中表達豐富，具有miR-7的應答元件，通過海綿作用減弱miR-7的生物學功能［18］。在星形細胞瘤中miR-7表達下調，使得膠質瘤迅速生長，但并非miR-7越高對腫瘤抑制性越強，有報道稱肺癌的不良預后就與miR-7的高表達有關［19］。②蛋白質的海綿作用。這種環狀RNA被稱為蛋白質海綿，如CDR1as／ciRS-7可與 AGO蛋白（Argonaute）結合，從而使自身被降解［20］。（2）轉錄調節。 如前所述，環狀 RNA具有轉錄調節作用。ciRNA中如錨蛋白重復域 52（ciankrd52）可與RNA聚合酶Ⅱ復合體相互作用，參與轉錄調節［21］。（3）翻譯作用。眾所周知，大多數環狀RNA屬于非編碼RNA，但仍有例外。如丁型肝炎病毒（HDV）的核心是一單股負鏈的circRNA，其可以轉錄翻譯成丁型肝炎核心抗原。（4）其他作用。Talhouarne等［22］發現ciRNA在細胞分裂過程中可遺傳給子代細胞，提示具有遺傳上的作用。由于穩定性好，環狀RNA可能存在其他生物學功能，比如作為組裝核糖體蛋白（RNP）顆粒的平臺，轉運其他蛋白質或其他RNAs的良好介質，這也為新型腫瘤藥物的研發提供了新視角。

2 環狀RNA與腫瘤

近年來，環狀RNA在腫瘤方面的研究已經取得了一定的成果。如Huang等［23］對結腸癌的分析表明，cir-ITCH在結腸癌中表達明顯下降，通過海綿作用與親本的 ITCH基因競爭 miR-7和 miR-20，抑制Wnt／β-catenin 信號 傳 導通路；Li等［24］發現 circRNA002059在胃癌中表達下降，與胃癌的惡性程度、轉移等相關；Huang等［25］發現circRNA MYLK可以競爭性結合 miRNA-29a-3p，導致膀胱癌的發生；Xuan等［26］研究指出，has-circ-100855在喉癌上調明顯，而has-circ-104912在喉癌中卻下調明顯等，諸多研究均提示環狀RNA在腫瘤發生發展中扮演著重要角色。

3 環狀RNA與膠質瘤

3.1 環狀RNA與膠質瘤的研究逐步興起Song等［27］研發了一種UROBORUS新型檢測工具，他們利用46個膠質瘤（包括少突膠質細胞瘤和GBM）和正常腦組織樣本作研究，發現所有樣本中高表達的環狀RNA的外顯子數量沒有顯著的差異，大約10%的環狀RNA只含有一個外顯子；而且大多數環狀RNA反向剪接點的基因長度在50 kb內，只有少數在100～300 kb之間。此外，研究還發現RIMS基因在正常腦組織會產生5種環狀RNA異構體，而在膠質瘤中只有2種，這提示膠質瘤會減少RIMS基因形成環狀RNA異構體的數量。然而，并非所有基因都是如此，VCAN在正常腦組織和膠質瘤組織中形成環狀RNA異構體數量沒有差別，但circ_VCAN的表達在膠質瘤中卻比正常腦組織高，而且有實驗［27-28］證實VCAN基因是形成膠質瘤的責任基因。GBM中表達的circ_COL1A2、circ_PTN、circ_VCAN、circ_SMO、circ_PLOD2、circ_GLIS3、circ_EPHB4、circ_CLIP2 較正常腦組織高，提示此8種環狀RNA有可能成為GBM的腫瘤標志物。

3.2 多形性膠質母細胞瘤 （glioblastoma multiforme， GBM）GBM 涉及 miR-671-5p／CDR1-AS／CDR1／VSNL1軸的表達失調［29］。 小腦退化相關蛋白1 反義轉錄物（CDR1-AS）是 2011 年由 Hasen 等［30］發現的一類環狀RNA，具有miR-671-5p的結合靶點，在GBM細胞中表達下調。Barbagallo等［29］研究了45位GBM患者的活檢組織和5個 GBM（分別是A172，CAS-1、DBTRG、SNB-19、U-87）細胞株，發現 miR-671-5p在GBM活檢組織和細胞株中均過度表達，其中miR-671-5p在A172、CAS-1、DBTRG細胞株中的表達超過其他腫瘤細胞株（A375，HCT116）的兩倍。且發現 CDR1-AS、CDR1、視錐蛋白樣因子 1（VSNL1）作為miR-671-5p的下游分子，在GBM細胞中表達減少，與miR-671-5p表達呈負相關，其中 CDR1-AS表達下調了 3.51 倍，CDR1 下調了 2.84 倍，VASNL1 下調了 2.1倍，而且發現miR-671-5p能促進GBM細胞的轉移和增殖。轉染miR-671-5p的類似物24 h后，發現DBTRG、SNB-19、U-87細胞株中GBM細胞的轉移能力分別增加了15%、32%、15%。DBTRG細胞株轉染miR-671-5p類似物24 h后生存能力增加了16%，而使用抑制物72 h后則使其生存能力下降了12%；同樣，SNB-19細胞株轉染類似物48 h后，其生存力增加了9%，轉染抑制物72 h后，下降了7%；U-87細胞株轉染miR-671-5p類似物后，生存能力增加了5%，而轉染抑制劑48 h后，生存能力會下降19%；故此推測GBM 涉及 miR-671-5p／CDR1-AS／CDR1／VASNL1 軸的表達失調。

3.3 膠質瘤涉及 circ-TTBK2／miR-217／HNF1β／Derlin-1軸的表達失調TTBK2環狀RNA（circ-TTBK2，根據環狀 RNA數據庫也稱 circ-0000594），由TTBK2基因的外顯子 3、4、5、6產生，不含內含子，定位于胞漿中，Zheng等［29］發現與正常腦組織相比，circ-TTBK2在膠質瘤中明顯表達上調，能抑制腫瘤細胞的凋亡，而且和膠質瘤的病理分級呈正相關。此外，利用正常星形膠質細胞作對比，發現miR-217在膠質瘤U87和U251細胞株表達下調，而且使miR-217恢復正常表達能起到抑制膠質瘤細胞增殖的作用，因此推測miR-217在膠質瘤中發揮了腫瘤抑制作用。進一步指出circ-TTBK2以RNA誘導的沉默復合體（RISC）的方式減少miR-217在膠質瘤細胞的表達。肝細胞核因子1β（HNF1β）定位在胞核，它不僅是肝臟特殊轉錄因子，而且在膠質瘤細胞中表達上調。在細胞株中加入 circ-TTBK2抑制子和／或使miR-217過表達，HNF1β表達量均明顯減少，為了更深入了解 miR-217與 HNF1β的關系，將 HNF1β的3′-UTR 和非HNF1β 3′-UTR 作比較，結果是膠質瘤細胞在 miR-217+HNF1β 3′-UTR 組比 miR-217+HNF1β的遷移性和侵襲性要高，這表明miR-217是通過和HNF1β 3′-UTR相互作用調節信號傳導通路的。HNF1β作為Derlin-1的啟動子促進Derlin-1的表達，而Derlin-1則是通過激活PI3K／AKT／ERK發揮致癌因子的作用，促進膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，抑制細胞的凋亡。和circ-TTBK2相似，HNF1β也與膠質瘤的病理分級呈正相關。

3.4 沉默 cZNF292 能通過 Wnt／β-catenin 信號傳導通路抑制膠質瘤血管生成和細胞增殖cZNF292是一種致癌性的環狀RNA，通過作用于Wnt／β-catenin通路即 Axin／β-catenin／APC／STAT3／5 通路在腫瘤的血管生成和細胞增殖方面扮演了重要角色。Yang等［30］在體外U87MG和U251膠質瘤細胞株中，沉默cZNF292的表達，發現血管內皮生長因子A（VEGF-A）及其受體 1／2（VEGFR-1／2）、磷酸化的血管內皮生長因子受體（p-VEGFR-1／2）、內皮生長因子（EGF）、內皮生長因子受體（EGFR）及轉化生長因子β1（TGF-β1）表達水平均下降，這提示沉默cZNF292的表達可抑制膠質瘤的血管生成。另外，膠質瘤細胞周期會停留在S／G2／M期，這是由調控細胞周期增殖的Wnt／β-catenin信號傳導通路，包括軸蛋白（Axin）、β-鏈蛋白（β-catenin）、磷酸化轉錄激活因子 3（p-STAT3）、磷酸化轉錄激活因子5（p-STAT5）及其下游效應分子如周期蛋白 A（cyclinA）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK2）、多脯氨酸蛋白 11（PRR11）等表達失調所致，當然其中還涉及其他分子如 E2F1、NF-κB、Sp1、HIF-1、AP-1等的轉錄下調。而CyclinA的作用就是激活CDK2推動細胞增殖周期從S期進入G2期。然而更深層次的調控機制有待進一步研究。

3.5 circBRAF可以用來預測GBM患者的無進展生存期和總生存期circBRAF定位在7號染色體，由BRAF基因的外顯子產生，BRAF基因可能與多種信號調節通路有關，包括Erb信號通路、MAPK信號通路、神經營養因子信號通路、mTOR信號通路。Zhu等［31］在研究中指出，相對正常腦組織，circBRAF的表達在膠質瘤患者低，而且高級別的GBM（WHO分級Ⅲ～Ⅳ）表達比低級別的GBM（WHO分級Ⅰ～Ⅱ級）低，提示circBRAF表達量高的GBM患者無進展生存期和總生存期較好。具體的機制尚不清楚，可能是因為下調表達環狀RNA參與了神經營養因子信號通路。另外，Zhu等［31］在研究中發現了1411種差異表的達環狀RNA，GO分析表明，下調的環狀RNA與蛋白結合及修飾、轉運活動、細胞器組織等有關，上調的環狀RNA與受精、G0到G1期的轉變、錳離子轉運、精子獲能、鈣池操縱的鈣離子通道活動、肌動蛋白依賴性ATP酶有關。

4 問題與展望

迄今為止，人們對circRNA認識大多數屬于起步階段，尤其是在膠質瘤領域，雖有研究表明膠質瘤涉及相關circRNA的改變，但深層次的機制仍不清楚，甚至部分環狀RNA是否真正與膠質瘤有關仍需進一步研究，而且實驗研究面臨著儀器設備昂貴、技術要求高、分析普窄等問題。將circRNA應用于臨床疾病診治還有很長的路要走，但毫無疑問，對circRNA的研究可能為神經系統膠質瘤的診治提供新的方向和思路，打開更為廣闊的空間。