自然妊娠與輔助生殖妊娠早期流產染色體非整倍體發生的比較

向菁菁，劉敏娟，毛 君，劉英華，張建林，張玉泉，李 紅，王 挺，李海波

（1南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心，江蘇 蘇州215002；2江蘇南通大學附屬醫院婦產科，江蘇 南通226000）

0 引言

統計數據顯示只有25%～30%的妊娠能夠最終得到活產，而其他70%～75%的妊娠終止在各個孕期，大部分是由于染色體異常。而對于懷孕前三個月的流產，約50%是由于染色體異常導致［1］。因此，對早期停止發育的胚胎進行染色體檢查對指導再次生育具有重要的意義。輔助生殖技術（assisted reproduction technology，ART）指利用醫療技術對配子、合子、胚胎進行人工操作，以達到受孕的目的，包括宮腔內人工授精（intrauterine insemination，IUI）和體外受精-胚胎移植技術（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）及其各種衍生技術。ART能夠有效治療不孕癥，在臨床上已經得到廣泛應用，但由于高流產率，成功生育率仍然較低。為比較自然妊娠與輔助生殖技術妊娠早期流產胎兒的絨毛染色體非整倍體發生情況，本研究對自然妊娠和輔助生殖妊娠中698例早期流產絨毛運用CNVplex高通量多重基因拷貝數檢測技術進行分析，比較兩組人群早孕期流產樣本染色體非整倍體情況，并進一步探討ART技術對胚胎非整倍體發生的影響。

CNVplex高通量多重基因拷貝數檢測技術用于檢測染色體非整倍體，共設計有170對探針，分布在24條染色體的著絲粒兩側及染色體末端約0 Mb、10 Mb、20 Mb處進行探針設計，平均每條染色體覆蓋5～8條。該體系可用于檢測每條染色體靶定區域的拷貝數情況，以及染色體的末端缺失或重復。2017年一篇關于CNVplex技術用于流產物檢測的文章中提到，CNVplex對于流產物的檢測結果與aCGH的結果完全一致，因此該技術可作為自然流產后有效的篩查方式［2］。 2017年國內另一項研究［3］對 60例反復自然流產病例的絨毛樣本分別進行多重DNA拷貝數（CNVplex）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術檢測，所有樣本同時行絨毛培養核型分析驗證。結果48例培養成功的流產絨毛樣本中，染色體異常率為60.42%。其中48例CNV-plex檢測結果與核型分析相一致，而FISH檢測結果中與核型分析結果相符的只有38例。對于非嵌合體和非結構異常樣本，兩種方法與細胞遺傳學核型分析結果符合率分別為100%（CNVplex）和79.17%（FISH）［3］。本研究旨在通過具有更高成本效能比的檢測方法，對常規與輔助生殖流產的絨毛樣本檢測分析，以期揭示兩組在染色體異常方面的差異。

1 資料和方法

1.1 一般資料選擇2015年6月至2017年3月在蘇州市立醫院生殖與遺傳中心門診就診，經臨床確診為胚胎停止發育而行手術清宮的孕婦698例，年齡21～43歲，孕齡為5～15周。分成兩組：自然妊娠組和輔助生殖組，基本情況見表1，兩組年齡（P＝0.000 04）和孕齡（P ＝0.002）比較，差異有統計學意義。

表1 兩組流產絨毛基本情況

1.2 方法

1.2.1 絨毛DNA的提取 挑取流產絨毛約15 mg，用Qiagen試劑盒提取DNA。DNA濃度和OD（260 nm）／OD（280 nm）比值用Nanodrop-1000測定，其 OD260／OD280 比值為 1.6～1.8，并將 DNA 稀釋至25 ng／μL。

1.2.2 CNVplex檢測及數據分析 采用天昊生物醫藥科技（蘇州）有限公司N1008人類24條染色體非整倍體檢測試劑盒。試劑盒共設計了170對探針，保證每條染色體至少被5對探針覆蓋，這些探針在1個連接反應體系中完成連接，連接產物隨后進行PCR反應擴增，擴增產物進行熒光毛細管電泳分離［2］。具體實驗方法如下所述。①連接反應。每個反應孔中加入總量150 ng的相應體積的DNA樣本，并用滅菌純凈水補齊至8 μL，陰性對照直接加8 μL洗脫液。按說明書配制預混合液體系，混勻后每管分裝10.5 μL到反應孔中，置 PCR儀上進行如下反應：98℃ 2 min ；95℃ 30 s，60℃ 3 h 5 個循環；60℃保存。連接反應共15 h，反應結束后加入20 μL“終止液”終止反應并混勻。②連接產物多重熒光PCR擴增。對連接探針產物，進行多重PCR擴增。按說明書配制預混合液體系：混勻后每管分裝19 μL，加入1 μL連接產物，置PCR儀上進行擴增：95℃ 2 min；94℃ 20s，62℃ -1℃ ／cycle 40 s，72℃ 1.5 min 共 5 個循環；94℃20 s，57℃ 40 s，72℃ 1.5 min 共 27 個循環；68℃30 min；4℃保存。③擴增產物熒光毛細管電泳分離。取 1 μL 擴增產物稀釋液與 0.1 μL LIZ500，8.9 μL Hi-Di混勻后，95℃ 5 min變性后上ABI測序儀。④數據分析。目標峰高的數據由GeneMapper讀取，進而對樣本目的區域的拷貝數進行分析確定。

1.3 統計學分析采用SPSS19.0軟件進行統計分析處理，計數資料用率表示，兩組間的比較用t檢驗，卡方檢驗或Fisher精確檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組流產絨毛染色體非整倍體情況698份流產絨毛中非整倍體共計308例，異常率為44.12%（308／698）。自然妊娠組流產絨毛正常整倍體為328例，非整倍體 255 例，異常率為 43.73%（255／583）。輔助生殖組流產絨毛正常整倍體為62例，非整倍體53例，異常率為 46.08%（53／115）。 兩組異常率比較，差異無統計學意義（P＝0.643，表 2）。

表2 兩組流產絨毛染色體非整倍體情況

2.2 流產絨毛染色體非整倍體的類型流產絨毛染色體非整倍體中以三體型最為常見，占78.90%（243／308）。常染色體除了1號，19號三體未被檢出，其他染色體的三體都有檢測到，最常見的為16三體，22三體和21三體。特納綜合征（45，X）也是常見的異常核型（表3）。各種非整倍體類型的比例在兩組流產絨毛中無顯著性差異（表3）。

兩組流產絨毛染色體核型分析結果

2.3 胚胎性別與核型異常的關系698份流產絨毛樣本中男性胚胎占 48.14%（336／698），女性胚胎占51.86%（362／698），男女性別比例無顯著性差異（P＝0.164）。男性胚胎中染色體異常的胚胎占42.86%（144／336），女性胚胎中染色體異常的胚胎占45.30%（164／362），異常胚胎在兩種性別胚胎中的比例無顯著性差異（P＝0.515，表 4）。

表4 胚胎性別與染色體核型異常的關系

3 討論

近年來，妊娠早期流產的發病率呈上升趨勢，是一種病因復雜的常見病。流產絨毛細胞染色體檢查有助于醫生了解胚胎細胞的遺傳特點，為查找流產病因提供理論依據。引發胚胎停育及早期流產的原因包括遺傳學因素、內分泌因素、免疫因素和環境因素等，排在第一的仍是染色體異常，異常率為50%～80%［4］。本研究的698例流產絨毛樣本中，檢出染色體非整倍體308例，異常率為44.12%。其中自然妊娠組的非整倍體發生率為43.73%，輔助生殖組的非整倍體發生率為46.08%。本研究中輔助生殖組女性平均年齡高于自然妊娠組，平均孕齡低于自然妊娠組，但自然妊娠組與輔助生殖組非整倍體發生率無顯著性差異。隨著女性年齡增加，不孕年限增加，接觸外部環境污染機會增多，出現減數分裂錯誤率增加，卵子質量下降，胚胎非整倍體發生率增加［5］。而輔助生殖中男方精子數量、女方年齡、卵巢功能、用藥方案、子宮內膜容受性及內膜厚度是影響妊娠結局的重要因素，以上因素中很多也是染色體異常的高危因素，但輔助生殖是否使染色體異常的風險增加尚無定論［6-8］。

有文獻［9］報道引起自發流產最多的是16號三體，其次是21號三體和22號三體。本研究結果中16號三體最多72例，其次是22號三體34例和21號三體18例，與之前報道一致。此外，特納綜合征（45，X）病例大多數在胚胎期流產，只有少數可以存活，本研究共檢出33例，也是常見的異常核型。本研究也對各種非整倍體類型的比例在兩組流產絨毛中的差異進行了統計學分析，結果顯示均無顯著性差異。

本研究發現在早期流產的胎兒絨毛組織樣本中，女性胚胎的比例與男性胚胎相比，差異無統計學意義（51.86%vs 48.14%，P＞0.05），核型異常胚胎在兩種性別胚胎中的比例差異也不顯著。但有文獻［10-11］報道早期流產的胎兒絨毛組織樣本中女性胚胎比例明顯高于男性，具體機制仍未知，可能是其他因素導致，也有可能是因為收集的樣本數量有限，后續可能需要更大的樣本量來證實。

綜上所述，胎兒的染色體異常是臨床上自然流產的主要誘因。如果能對流產的胚胎進行大規模的染色體非整倍體分析及相關的生化檢測，將有效地提高優生優育工作的效率。本研究采用的CNVplex技術探針分布廣，每條染色體設計5～8個探針，24條染色體共計170個探針，保證了染色體覆蓋的廣度和深度，使檢測結果更精準，其操作更簡便，快捷，通量高。該技術除可檢測24種染色體數目異常，還可檢測5Mb以上的缺失或重復，但CNVplex也存在一定局限性，例如無法檢測到流產絨毛染色體中嵌合體的比例，多倍體以及平衡易位、倒位等染色體結構異常。但這些異常情況在流產樣本中合計所占比例為10%～15%，可通過 CNVplex初篩后的其他成本高（如SNP-array）技術補充，以實現最高的檢測成本效能比。近年基因芯片技術和高通量測序技術也被用來進行流產絨毛染色體的檢測，這些新技術具有高準確性、高通量、高靈敏度等優點，不僅能夠檢測染色體非整倍體，還能夠檢測精細拷貝數變異（copy number variation， CNV）［12-15］。 這些技術的聯合應用可以更為準確地診斷流產的遺傳病因，更加有利于臨床醫生快速尋找流產原因，指導下次備孕。