青藤堿長循環脂質體的制備工藝研究*

霍仲堅，李婷婷，李木生，王 嬰，王 巖（廣東藥科大學，廣東廣州510006）

青藤堿（sinomenine）是從防己科植物青藤或毛青藤的藤莖中提取的生物堿單體成分，臨床常用于治療各種風濕及類風濕性疾病[1-2]。最新研究發現，除具有鎮痛抗炎、免疫作用外，青藤堿對各種惡性腫瘤細胞的增殖也具有較強的抑制作用，如肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和宮頸癌等[3-6]。青藤堿具有作用靶點廣、治療效果好等優勢。但由于其生物半衰期較短，臨床治療一般需長期大劑量給藥才能使藥效持續，劑量增大后在體內能促進組胺釋放而致皮疹、粒細胞減少等嚴重的臨床不良反應[7]。

長循環脂質體是在普通納米脂質體的處方中，加入聚乙二醇（PEG）等親水性物質修飾其表面，經靜脈滴注進入體內后，由于極性增加，可延長其在循環系統的滯留時間，增加消除半衰期。除了可發揮一般納米給藥系統對網狀內皮系統豐富的器官如肝、脾、腎的靶向性以外，還可起到緩釋和降低毒性的作用。

本研究采用薄膜分散超聲法制備青藤堿長循環脂質體，以包封率為指標，采用正交試驗設計優化脂質體的制備工藝。

1材料與方法

1.1 材料 LC-10A高效液相色譜儀（日本島津）；Diamonsil C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm）；青藤堿對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號：110774-200507）；卵磷脂（上海藍季，批號：140729）；膽固醇（上海潤捷，批號：20090203）；PEG2000（天津大茂，批號：20141206B）；PEG4000（天津福晨，批號：140125）；PEG6000（天津大茂，批號：150106）。

1.2 方法

1.2.1 含量測定方法的建立

1.2.1.1液相色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合相硅膠為吸附劑，流動相為甲醇-水（25：75，用三乙胺調節pH至9.0），檢測波長為262 nm，流速為0.9 mL/min，柱溫為25℃，進樣量為20μL。理論板數按青藤堿峰計算，不得低于2 000。

1.2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取青藤堿對照品11.2 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為0.448 mg/mL的對照品溶液。

1.2.1.3 標準曲線的制備 分別精密量取上述青藤堿對照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列對照品溶液。精密吸取20μL，按上述色譜條件進樣測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.1.4 精密度試驗 精密吸取濃度為0.089 6 mg/mL的青藤堿對照品溶液20μL，按上述色譜條件連續測定6次，記錄峰面積，計算RSD。

1.2.1.5 包封率測定 取底部開口的微柱離心管，填入SephadexG-50葡聚糖凝膠2g，加蒸餾水浸沒，3000r/min離心5 min脫水，同法操作3次，使凝膠貼緊柱底部。精密量取青藤堿長循環脂質體乳液1 mL，加至柱床頂端，待樣品溶液完全吸附后，加入pH7.2磷酸鹽緩沖液5 mL，3 000 r/min離心15 min，收集洗脫液，轉移至10 mL量瓶中，用無水乙醇定容，作為過柱后供試品溶液。另精密量取青藤堿長循環脂質體乳液1 mL，置10 mL量瓶中，加無水乙醇約9 mL，超聲破乳至溶液變澄清，放冷，加無水乙醇至刻度，搖勻，作為過柱前供試品溶液。將上述兩種供試品溶液分別注入液相色譜儀，記錄峰面積，以過柱后與過柱前的峰面積比計算青藤堿的包封率[8]。

1.2.1.6 穩定性試驗 精密吸取“1.2.1.5包封率測定項下”的同一份過柱前供試品溶液20μL，每隔2小時進樣一次，記錄峰面積，計算RSD。

1.2.1.7 重復性試驗 取青藤堿長循環脂質體一批，按“1.2.1.5包封率測定項下”的方法平行制備6份過柱前供試品溶液，精密吸取20μL進樣測定，計算RSD。

1.2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的青藤堿長循環脂質體一批，按1∶1比例加入青藤堿對照品溶液，余按照“1.2.1.5包封率測定項下”的方法操作，測定過柱前脂質體中青藤堿的含量，計算回收率。

1.2.2 制備工藝優選

1.2.2.1 單因素試驗 按處方稱取青藤堿5 mg、膽固醇10 mg、大豆卵磷脂40 mg，置50 mL茄形瓶中，加入25 mL無水乙醇溶解，在50℃下旋轉蒸發使其形成一層均勻薄膜，備用。另取PEG2000、PEG4000及PEG6000各2.5 mg，加入pH7.2磷酸鹽緩沖液10 mL使溶解，制成分散相。將分散相溶液加至茄形瓶中，振搖使薄膜脫落并均勻分散，轉移至具塞錐形瓶中，超聲處理30 min，用0.45μm微孔濾膜濾過。精密量取1 mL，按照“1.2.1.5包封率測定項下”的方法操作，測定包封率。

1.2.2.2 正交試驗設計 在預實驗及參考文獻的基礎上，采用L16（4）5正交表設計實驗方案[9-11]，以包封率為指標，篩選藥脂比（青藤堿∶卵磷脂）、膽脂比（膽固醇∶卵磷脂）、PEG6000含量（%，處方總占比）、超聲時間（min）等四因素的適宜條件。因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.3 統計學處理 采用正交設計助手Ⅱ3.1對實驗結果進行極差和方差分析。首先根據各因素不同水平包封率均值的極差大小確定因素的主次順序。同時以誤差為參比，根據離均差平方和對實驗結果進行方差分析和顯著性檢驗，得出優選工藝。

2 結 果

2.1 含量測定方法學考察結果 青藤堿對照品峰面積對進樣量的回歸方程為Y=310 641X-29 013，r=0.999 1，青藤堿在0.448～4.480μg內呈良好的線性關系。精密度測定峰面積的RSD為1.69%，表明儀器測定具有良好的精確性。穩定性試驗結果8 h內峰面積的RSD為2.56%，10 h后RSD則大于3.00%，峰面積逐漸呈下降趨勢，表明供試品溶液可在8 h內保持穩定。重復性試驗結果測得青藤堿含量的RSD為1.99%，結果表明本法具有良好的重復性。6批樣品的平均回收率為95.72%，RSD為2.69%，結果表明本法具有良好的準確度。

2.2 制備工藝優選結果 以PEG2000、PEG4000及PEG6000制得脂質體的包封率分別為50.5%、46.7%、52.1%。結果表明，以PEG6000為表面修飾劑時包封率最高。

正交試驗結果及直觀分析結果見表2，方差分析結果見表3。由極差的大小排序可知，對青藤堿包封率影響最大的因素是藥脂比，影響最小的為PEG6000含量；方差分析結果表明，藥脂比與膽脂比對實驗結果影響顯著，而PEG6000含量與超聲時間對實驗結果影響不大。青藤堿長循環脂質體的制備條件最終確定為A3B3C1D1，即藥脂比為 1∶8，膽脂比為 1∶3，PEG6000 含量為0.25%，超聲時間為15 min。按優選工藝進行驗證試驗3批，測得包封率為61.25%、60.17%、62.33%，表明工藝穩定可行。

表2 正交試驗及直觀分析結果

表3 方差分析結果

3 討 論

脂質體的包封率測定方法有微柱離心法、透析法、凝膠過濾法等[12]。預實驗時曾對上述方法進行了比較研究，結果三種方法測得包封率的平均值差異不大，但微柱離心法較透析法、凝膠過濾法具有更好的穩定性和重復性。

在長循環脂質體中，表面修飾劑的種類和用量主要影響脂質體的包封率和給藥系統在體內的循環時間。單因素實驗結果表明，采用不同相對分子質量的PEG制成脂質體的包封率差異較大，以PEG6000的結果最佳。正交試驗結果表明，PEG6000的處方用量對脂質體的包封率無明顯影響，本實驗暫定其用量為處方量的0.25%，該比例尚需在動物體內的藥動學研究中進一步確定。

正交試驗結果表明，PEG6000的處方用量對脂質體的包封率無明顯影響，因而暫定其用量為正交設計的最小用量。

本研究采用正交試驗法對青藤堿長循環脂質體的制備工藝進行了工藝優化。所得工藝操作簡便，重復性好，包封率高。但由于制備工藝研究中僅以包封率為指標，無法體現優選工藝的體內長循環效果，故該工藝尚需通過動物體內的藥動學研究進行驗證。

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