白藜蘆醇通過誘導自噬改善高脂飲食小鼠非酒精性脂肪肝

陸奇群 張 曦

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）指除酒精和明顯的肝損害因素之外的其他原因導致的，病理特征為肝細胞彌漫性大泡性脂肪變性的臨床綜合征[1]。在我國NAFLD患病率達20.9%～42%[2-3]。NAFLD可進一步發展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化，甚至轉變為肝細胞癌（HCC）[4]。NAFLD患者罹患2型糖尿?。═2DM）及其并發癥的風險明顯高于正常人[5]。流行病學調查[6]顯示，NAFLD為骨質疏松、冠心病和結直腸腫瘤的高危因素。白藜蘆醇（resveratrol，Res）為一種非黃酮類多酚化合物，已被證實可有效改善NAFLD小鼠肝臟病變程度[7]。自噬（autophagy）在NAFLD的發生、發展中發揮重要作用。自噬可降解肝細胞內脂滴，減輕炎癥反應，改善肝細胞脂肪變性[8]。本研究從自噬角度出發，觀察Res對NAFLD小鼠的改善作用及其對自噬相關蛋白p62和通路蛋白磷脂酰肌醇-3-羥基激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、絲氨酸-蘇氨酸激酶（serine-threonine kinase，AKt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的影響，探討Res治療NAFLD的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥物 健康SPF級雄性C57BL/6J小鼠45只，6周齡，體質量18～20g，購自浙江大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（浙）2016-0031。Res購自南京澤朗醫藥科技公司，批號160504。

1.2 主要試劑和儀器 胰島素酶聯免疫（ELISA）試劑盒，購自美國R&D公司，批號SJH16887。血糖試紙購自深圳瑞迪恩科技公司，批號TS21DD4Q2409。p62（批號 51145）、PI3K（批號 42925）、Akt、mTOR 一抗（批號29725）購自美國Cell Signaling公司。二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司，批號166818B。Western blotting相關試劑購自江蘇碧云天生物技術研究所。DXC 800全自動生化儀購自美國Beckman公司。

1.3方法

1.3.1 造模和分組 參照文獻[9]予高脂飼料（68.5%基礎飼料＋15%豬油＋1%膽固醇＋15%糊精＋0.5%膽鹽）共8周復制小鼠NAFLD模型，并經肝臟病理檢查符合NAFLD判斷標準[10]。將45只C57BL/6J小鼠隨機分為模型組、觀察組和正常對照組，各15只，均自由飲水。模型組和觀察組予高脂飼料復制NAFLD模型。造模成功后，模型組予高脂飼料＋生理鹽水10mL/kg，1天1次灌胃，觀察組予高脂飼料＋Res 100mg/kg，1天1次灌胃，連續2周。正常對照組始終予基礎飼料。

1.3.2 標本采集 給藥結束后，禁食12h，以2%戊巴比妥麻醉后，股動脈放血法處死小鼠，取3mL血離心取上清以檢測血清學指標，同時取肝臟組織適量制成勻漿用于Western blot檢測。

1.3.3 血清學指標 血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平采用全自動生化儀檢測。血清空腹血糖（FBG）和胰島素（FINS）水平分別采用試紙和ELISA試劑盒測定。胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=FINS（mU/L）×[FBG（mmol/L）/22.5][11]。

1.3.4 Western blot檢測p62及通路蛋白 取適量肝臟組織經勻漿離心后，加蛋白裂解液，提取總蛋白。取30～50μg蛋白，經10%SDS-PAGE凝膠100V 1h電泳后轉至硝酸纖維素膜，封閉液中37℃ 2h；加入 p62、PI3K、Akt、mTOR 一抗 4℃過夜。反復洗膜1h，加入二抗孵育1h，洗膜后加入ECL發光劑孵育5min，置于凝膠成像系統中成像。采用Gel Pro3.0軟件測定條帶積分光密度值（OD），以目的蛋白的OD值與內參的OD值的比值作為目的蛋白的相對OD值。

1.4 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件處理，計量資料采用（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠血清學指標比較 與正常對照組比較，模型組血清TG、TC、ALT、AST水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，觀察組血清 TG、TC、ALT、AST水平均顯著降低（P＜0.05）。各組FBG水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，模型組HOMA-IR水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，觀察組HOMA-IR水平顯著降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠p62及通路蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型組肝組織中p62、PI3K、磷酸化（p）-Akt、p-mTOR 水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，觀察組肝組織中 p62、PI3K、p-Akt、p-mTOR 水平均顯著降低（P＜0.05）。見圖1（插頁）、表 2。

圖1各組小鼠p 62及通路蛋白的表達

3 討 論

NAFLD的發病機制較為復雜，遺傳因素、代謝紊亂、脂質過氧化及炎癥因子失衡等多種因素均發揮重要作用，而胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）為公認的關鍵因素。IR可促進脂質代謝紊亂，促使過多的游離脂肪酸向肝細胞聚集，進一步加重肝細胞脂肪變[11]。而且，過多游離脂肪酸可損傷線粒體，并造成氧化應激，產生大量氧自由基（ROS）[8]。

表1 各組小鼠血清學指標比較（±s）

表1 各組小鼠血清學指標比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；TG：甘油三酯，TC：總膽固醇，ALT：谷丙轉氨酶、AST：谷草轉氨酶，FBG：血清空腹血糖，HOMA-IR：胰島素抵抗指數

組別正常對照組模型組觀察組只數151515TG（mmol/L）0.72±0.124.55±0.28*1.86±0.18*△TC（mmol/L）3.15±0.268.79±0.35*5.36±0.31*△ALT（U/L）35.24±2.15154.18±8.33*55.62±4.35*△AST（U/L）51.39±3.87297.47±8.96*86.54±5.26*△FBG（mmol/L）5.38±0.455.52±0.475.46±0.42HOMA-IR 1.53±0.192.26±0.23*1.64±0.22△

表2 各組小鼠肝組織p62及通路蛋白表達比較（±s）

表2 各組小鼠肝組織p62及通路蛋白表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；PI3K：磷脂酰肌醇-3-羥基激酶；p-AKt：磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶；p-mTOR：磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

組別正常對照組模型組觀察組只數151515p620.97±0.061.45±0.08*1.04±0.07△PI3K 0.87±0.051.52±0.06*0.96±0.07△p-AKt 0.85±0.051.64±0.08*0.94±0.08△p-mTOR 0.68±0.031.12±0.04*0.59±0.02△

自噬（autophagy）為真核生物特有的進化上高度保守的分解代謝方式，廣泛參與機體的生理病理過程。研究[12]表明，自噬與NAFLD之間存在密切關系。研究[13-14]表明，自噬可降解肝細胞內的脂滴，進而改善脂肪肝。自噬相關基因Atg5敲除的小鼠高脂飲食后肝細胞內脂質含量較正常鼠明顯增加。相反，自噬激動劑雷帕霉素可明顯降低肝細胞內的脂質含量[15]。而且，自噬可通過線粒體自噬來吞噬降解損傷的線粒體，進而減輕氧化應激[16]。p62為公認的自噬特異性底物及評價“自噬潮”的標志物。自噬發生時，p62水平下降；而自噬受抑制后，p62水平上升[17]。研究[18]表明，p62蛋白能解除Beclin1與Bcl-2之間的結合，游離Beclin1從而促使自噬的發生。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）屬于進化上較保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶之一，參與細胞發育、核糖體生成及代謝調控等生理過程，與糖尿病、心血管疾病及腫瘤疾病等多種疾病密切相關[19]。mTOR能負向調控細胞自噬體的形成，其活化程度能間接反映自噬水平。mTOR調控細胞自噬主要通過mTOR依賴性和非依賴性兩條信號通路發揮作用[20]。雷帕霉素可抑制mTOR活化，導致其下游p70S6激酶（S6kinase）活性降低，進而促進自噬發生[21]。研究[22]發現，磷脂酰肌醇 3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）/mTOR信號通路在自噬中發揮重要的調節作用，針對該信號通路的選擇性抑制劑在治療腫瘤方面已取得較為滿意的效果。

白藜蘆醇廣泛存在于如葡萄、花生及藜蘆等中，是一種天然的植物抗毒素，具有如抗氧化、抗炎、抗癌、免疫調節等生物學作用[23]。研究[24]發現，Res具有減輕肝細胞的脂質過氧化損傷，并改善肝臟功能。研究[25]顯示，Res可能通過下調肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（PPARγ）、脂肪酸結合蛋白（FABP）表達，進而發揮改善NAFLD的作用。研究[26]發現，白藜蘆醇能上調NAFLD大鼠肝內AMP活化的蛋白激酶（AMPK）與沉默信息調節因子1（IRT1）表達，而下調固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）表達。目前針對NAFLD中Res對自噬影響的研究報道不多。

本研究顯示，Res干預可顯著改善脂代謝、IR和肝功能（P<0.05），與前期研究結果一致；同時，Res干預可顯著降低p62、PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達水平（P<0.05），這表明Res可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路進而誘發自噬。由于本研究樣本例數和設計的局限，Res對自噬的促進作用及其具體的mTOR信號通路尚需進一步研究證實。

綜上所述，Res可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路進而促進自噬，最終發揮改善NAFLD的脂代謝、IR和肝功能的作用。

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