TGF-β信號通路與軟骨終末分化及骨關(guān)節(jié)炎

萬小滿，閆繼紅

(1.首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 13級七年臨床醫(yī)學兒科，北京100069；2.首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 組胚教研室)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，在中老年人群中發(fā)病率高，嚴重者可致殘，從而影響人們的生活質(zhì)量。

其病理改變涉及關(guān)節(jié)整體結(jié)構(gòu)，包括關(guān)節(jié)軟骨破壞，軟骨下骨硬化，骨贅形成以及滑膜增生等[1]。目前已知的有關(guān)病因主要與年齡、性別、力學壓力(肥胖)以及創(chuàng)傷有關(guān)[2]。然而有關(guān)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的精確的分子機制目前還不完全清楚。

最近轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明轉(zhuǎn)錄生長因子-β(TGF-β)信號通路在OA的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，可促進軟骨細胞向肥大化發(fā)展，促進骨原細胞分化成成骨細胞和軟骨下骨中的血管生成，以及刺激滑膜相關(guān)細胞增殖和滑膜的纖維化[3]。

TGF-β信號通路是一個包含眾多成員的多功能細胞因子的超家族，主要調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等過程[4]。在軟骨發(fā)生中，TGF-β信號發(fā)揮著重要的功能，包括間充質(zhì)細胞聚集、軟骨細胞增殖、細胞外基質(zhì)沉積和最后終末分化都起重要作用。有研究報道：TGF-β不僅可以引發(fā)軟骨基質(zhì)的合成，而且也可以參與OA的發(fā)生及發(fā)展過程。如參與：(1)募集前成骨細胞；(2)軟骨下骨的病理重建；(3)骨贅的形成，促進軟骨細胞的終末分化等。本文就目前TGF-β信號通路在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生中的有關(guān)調(diào)節(jié)機制予以綜述。

1 TGF-β信號通路

目前已知在TGF-β信號通路超家族中除了 TGF-β外，還包括活化素(activin)、抑制素(inhibin)、生長分化因子(GDFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)等不少于35個成員組成。TGF-β超家族信號通路中與軟骨發(fā)育有關(guān)的主要為Smad2/3介導的TGF-β信號通路與Smad1/5/8介導的BMP信號通路。其中由TGF-β信號引發(fā)的Smad信號通路在軟骨和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生中越來越受到關(guān)注。經(jīng)典TGF-β信號通路(BMP信號通路作用類似)主要通過TGF-β配體-膜受體(Receptor)-Smad信號通路發(fā)揮誘導成軟骨的生物功能。TGF-β受體分為TβRⅠ型、TβRⅡ型和TβRⅢ型，其中TβRⅠ起著承上(與TGF-β結(jié)合)和啟下(活化Smads)的作用，配體與TGF-βR結(jié)合導致TGF-βRⅡ磷酸化，活化的Ⅱ型受體構(gòu)象發(fā)生改變并識別Ⅰ型受體，對Ⅰ型受體胞內(nèi)側(cè)絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，活化后的Ⅰ型受體活化細胞內(nèi)效應分子Smad，進而調(diào)控一系列生物學功能[3]。

1.1 TGF-β配體

在哺乳動物中，有三種TGF-β，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，[5]且這3種TGF-β在軟骨細胞與肥大的軟骨細胞中均有表達[6]。

TGF-β是間充質(zhì)前體細胞軟骨發(fā)生的主要發(fā)起者，間充質(zhì)干細胞(MSCs)分化為軟骨細胞也需要TGF-β的作用，通過TGF-β的強烈刺激誘導N-鈣粘蛋白的表達，來增強細胞粘附，使細胞聚集。隨后促進細胞的增殖以及軟骨特異性細胞外基質(zhì)分子的沉積[7]。研究表明TGF-β是通過調(diào)控Sox9的表達來作為軟骨分化的正調(diào)控因子[8]。

大量研究已表明TGF-β與對軟骨發(fā)生具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β3可以刺激細胞外基質(zhì)的合成，在急性軟骨損傷的兔子模型中，可以提高軟骨的細胞外基質(zhì)的量[9-11]。

注射有活性的TGF-β1在受損的軟骨區(qū)，可分泌Ⅱ型膠原蛋白以及產(chǎn)生粘連蛋白使軟骨細胞能附著在受損部位[12，13]。最新的研究結(jié)果類似，Tang，Y等人通過腺病毒將TGF-β1基因轉(zhuǎn)染到兔子軟骨細胞中，結(jié)果顯示TGF-β1可以長時間的發(fā)揮作用，包括使軟骨細胞由多邊性變?yōu)樗笮位蚵褕A形，DNA合成以及聚蛋白多糖及Ⅱ型膠原蛋白表達均增加，而Ⅰ型膠原纖維表達明顯減少，另外明顯促進軟骨樣基因Sox9的mRNA的表達，并阻止肥大標志物COL10A1，減少MMP-13[14]。還有研究表明，TGF-β1可以有效的阻斷BMP9誘導的Smad1/5磷酸化和軟骨肥大樣改變[15]。

然而一些研究則顯示，TGF-β對軟骨還存在一些負面作用。它能誘導人的軟骨細胞MMP-13[16]和馬正常軟骨細胞的MMP-9[17]的合成增加。對于滑膜細胞，能增加MMP-1、聚蛋白多糖酶以及促炎因子的表達[18]。這些基因表達的提高會導致軟骨分解的加速。而局部TGF-β的聚集將會導致關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生骨關(guān)節(jié)炎樣變化。在體外和動物模型中也都證明TGF-β信號與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生相關(guān)。體內(nèi)的實驗證明，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中，TGF-β1和BMP2作為配體，活化Smad3，促進MMP13的表達，導致人骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和正常軟骨的破壞[19]。另外，異常激活TGFβ1導致軟骨下骨異常重塑和骨髓骨樣小島的形成[20]。

這些實驗結(jié)果表明，TGF-β在軟骨和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生中的作用是存在爭議的。

1.2 TGF-β受體

TGF-β受體分為TβRⅠ型、TβRⅡ型和TβRⅢ型，其中TβRⅠ起著承上(與TGF-β結(jié)合)和啟下(活化Smads)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞TGF-β不僅通過經(jīng)典的Ⅰ型受體ALK5介導Smad2/3信號，而且還可以通過ALK1受體介導Smad1/5/8通路[21]。

通過受體ALK5磷酸化Smad2/3的TGF-β信號通路可以使軟骨分化開始，但對軟骨終末分化有阻止作用。而通過受體ALK1/2/3磷酸化Smad1/5/8的BMP信號通路對于軟骨終末分化是有重要意義的，缺失Smad1和Smad5會阻礙軟骨細胞終末分化，并造成軟骨功能障礙。

有研究表明，隨著年齡的增加會減少ALK1的表達，但是，它減少的速度不如ALK5，提示在老化的軟骨細胞中，會由通過ALK5的Smad2/3信號通路轉(zhuǎn)向通過ALK1的Smad1/5/8信號通路，ALK5/ALK1比例的減小會導致軟骨細胞向骨關(guān)節(jié)炎特征表型的肥大方向分化[22]。van der Kraan等[22]的實驗也獲得相似的結(jié)果，年齡可導致ALK1/5的比例改變，發(fā)生軟骨肥大，此外，還發(fā)現(xiàn)人的骨關(guān)節(jié)炎軟骨中ALK1與MMP13的表達呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。由此可見，在骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞中，ALK5的減少改變了ALK5和ALK1的比例，從而TGF-β信號偏向于Smad1/5/8信號通路，使軟骨細胞發(fā)生終末分化。

1.3 Smad蛋白

Smad主要可分為三類，調(diào)節(jié)受體型Smad：Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，通用型：Smad4，負調(diào)節(jié)型Smad:Smad6和Smad7[24]。

大量研究證明負調(diào)節(jié)型Smad通過招募泛素化酶作用于相關(guān)蛋白，引起信號關(guān)閉。常見的泛素化酶包括Smurf1和Smurf2。

已有研究顯示Smad6和Smurf1是Smad1/5/8的BMP信號通路的抑制物，而Smad7和Smurf2則抑制Smad2/3信號通路。Smad6和Smurf1過表達的大鼠軟骨細胞中顯示正常的細胞增殖狀態(tài)，阻礙了軟骨細胞終末分化。在分化的雞軟骨細胞中，Smad6的過表達阻斷BMP-2誘導的軟骨細胞肥大。此外Smad6可與Runx2相互作用，增強Runx2通過蛋白酶體途徑降解。相反，在軟骨細胞中過表達Smad7，抑制了Smad2/3信號減少了軟骨細胞增殖，加速軟骨細胞的終末分化[24]，促進骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。此外，Smad7可下調(diào)p38MAPK蛋白激酶信號通路，阻止前軟骨細胞的分化過程[25]。

Smurf不僅可促進Smad降解而且可調(diào)節(jié)ALK半衰期。過表達Smurf1可通過減少Smad5，抑制Smad1/5/8信號，防止終末分化。相反，過表達murf2可下調(diào)ALK5水平[26]，抑制Smad2/3信號，加速軟骨終末分化，促進骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生[27]。發(fā)現(xiàn)對體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Smurf2功能缺失的小鼠可以減緩半月板損傷后骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的嚴重程度[28]。

由此可知：過表達Smad7和Smurf2或下調(diào)Smad6和Smurf1都會引起軟骨終末分化，促進骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

2 機械壓力與TGF-β信號通路

在引起骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的主要因素中，一個是生物因素，另一個重要因素是壓力誘導的軟骨損傷。

動物實驗研究表明，關(guān)節(jié)負荷過重會導致Sox9，Ⅱ型膠原蛋白表達減少，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨丟失和軟骨下骨密度降低[29]。

有研究表明，機械壓力會抑制軟骨中ALK5介導的Smad2/3通路的激活，但與年齡有關(guān)。老齡軟骨對機械壓力引起的ALK5-Smad2/3通路抑制作用更加明顯著，Ⅱ型膠原蛋白和纖維粘連蛋白表達相對于年輕軟骨大大減少[30]。有研究表明，人關(guān)節(jié)軟骨機械損傷導致Smad1和Smad5的磷酸化，Wnt信號上調(diào)，進而改變R-Smad信號平衡，刺激軟骨細胞的終末分化[31]。

軟骨細胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)[32]。 最近有研究顯示，機械壓力可通過上調(diào)miRNA-146a，進而抑制Smad4蛋白表達，誘導軟骨細胞凋亡，促進OA的發(fā)生[33]。

但也有實驗表明，過度的機械壓力單獨不會造成TGF-β信號由Smad2/3向Smad1/5/8轉(zhuǎn)變，相反，可保護關(guān)節(jié)軟骨，阻止軟骨的終末分化[34]。

3 TGF-β信號與其它信號通路交互共同調(diào)節(jié)軟骨分化

3.1 Wnt信號通路

Wnt信號系統(tǒng)在軟骨分化和軟骨發(fā)育中起重要作用。增強Wnt信號可直接對軟骨細胞分化產(chǎn)生影響，也可以通過調(diào)節(jié)Smad2/3和Smad1/5/8途徑的平衡來產(chǎn)生效應。 有研究證實，經(jīng)典的Wnt信號通路可以使TGF-β信號通路由ALK5介導的Smad2/3信號通路轉(zhuǎn)向ALK1介導的Smad1/5/8的BMP信號通路，導致軟骨細胞肥大，這可能是骨關(guān)節(jié)炎的病理機制之一[35]。

3.2 MAPK信號通路

研究發(fā)現(xiàn)，在OA軟骨中，p38MAPK的磷酸化增強[35]。 MAPK磷酸化，將改變Smad2/3與Smad1/5/8信號之間的平衡，促進軟骨終未分化[36]。

TGF-β可依賴p38信號通路介導Smad通路調(diào)節(jié)Sox9的磷酸化及其下游基因papss2 mRNA的表達。Sox9上第211個絲氨酸的作用位點負責應答TGF-β信號，而這個位點也是p38激酶的一個靶點，p38和Smad3可共同調(diào)節(jié)Sox9的表達[37]。

此外，TGF-β1通過 ERK1/2激酶磷酸化Smad3，誘導基質(zhì)蛋白酶抑制劑(TIMP-3)的上調(diào)[38]，而單獨ERK1/2并不能發(fā)揮作用。

4 TGF-β在治療骨關(guān)節(jié)炎中的應用

TGF-β家族，主要包括TGF-β1、TGF-β3或BMP-2，已證明能促進軟骨再生，而用于軟骨組織工程中。

TGF-β1可以抑制軟骨基質(zhì)降解酶和促進軟骨分解代謝的細胞因子白介素(IL)1。另外，TGF-β1能增強骨髓間充質(zhì)干細胞的成軟骨能力。因此，TGF-β1可作為軟骨修復一個不錯的選擇[39]。臨床試驗證明，TGF-β1基因修飾的軟骨細胞，具有修復損傷的軟骨的作用[40]。有研究顯示TGF-β3基因通過病毒感染到MSCs，可治療OA引發(fā)的軟骨損傷[41]。

然而，注射高劑量的TGF-β1進入關(guān)節(jié)內(nèi)可誘發(fā)炎癥細胞的趨化和激活，導致典型的軟骨缺陷如纖維化和骨贅的形成[42]。因此，TGF-β1應該管理在合適的范圍內(nèi)，將負面影響降到最低。

此外，由于TβRⅡ與軟骨細胞基質(zhì)的表達具有相關(guān)性。因此可以在軟骨細胞中高表TβRⅡ或者ALK5作為治療骨關(guān)節(jié)炎的手段。

5 問題與展望

目前，我國人群中骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率很高，嚴重地影響了人們的生活質(zhì)量。由于骨關(guān)節(jié)炎病因復雜，目前臨床上尚無有效的治療手段和藥物。闡明骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的分子機制對于更深入地研究有效的治療方法具有重要的意義。

TGF-β信號通路在調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的再生起了非常重要的作用，TGF-β信號通路中各種分子將可作為OA治療的靶點。因此，合理掌握TGF-β使用的劑量，通過阻滯ALK1，選擇性激活不同的Smad信號以及關(guān)鍵的下游靶基因，可以作為治療和干預OA疾病的潛在關(guān)鍵目標[3]。

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