循環腫瘤DNA在非小細胞肺癌中的研究進展

郭曉冬,姜曉峰,高 卓

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院 檢驗科,黑龍江 哈爾濱150001)

組織是腫瘤患者檢測最直接的臨床樣本，但由于腫瘤異質性的存在，目前的單一位點穿刺或活檢不能反映腫瘤的全貌，同時，有創檢測對于廣泛人群的早期篩查以及晚期腫瘤的惡病質患者也并不適用。血漿游離循環腫瘤DNA (Cell-free Circulating Tumor DNA，ctDNA)由于保持著與組織樣本一致的遺傳信息，現將其作為組織樣本基因學檢測的替代首選。本文將針對ctDNA的三種檢測方法(包括ARMS-PCR，dPCR和NGS)及其優缺點，包括其在NSCLC早期診斷，個性化治療和耐藥性監測，轉移復發與預后等臨床應用方面做一簡要概述，同時針對目前尚未解決的一些問題等方面提出思考意見。

肺癌是世界范圍最常見的惡性腫瘤之一，近2/3的患者在發現時已處于腫瘤晚期，由于機體狀況差等原因無法或很難獲得足量合格的組織樣本用于診斷及治療。液體活檢是指從體液中獲得來源于組織的生物學標志物，并通過對所得標志物的分析來反映其來源組織的相關信息[1]。這一檢測方法具備無創性、廣泛性、即時性等特點，具有廣闊的應用前景。目前常用的液體活檢分析對象主要包括循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)、外泌體(Exosomes)和游離腫瘤DNA(cell-free tumor DNA，ctDNA)。ctDNA來源于原發和轉移的腫瘤組織，存在形式更加穩定且易于檢測，可直接使用血漿樣本，這種檢測在具備無創性和可重復性的同時，還可有效的避免腫瘤本身存在的異質性。故本文就ctDNA在NSCLC中的應用做一介紹。

1 ctDNA的檢測方法及優缺點

游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)是指一般存在于血漿、血清、腦脊液中，由細胞凋亡、壞死釋放入體液的DNA片段，大小約為150-200 bp。正常個體中的cfDNA主要來自于凋亡的骨髓細胞和淋巴細胞，少部分來自于組織。目前cfDNA 已被廣泛應用于孕婦產前篩查(NIPT)、移植反應監測和腫瘤的個體化治療等方面。ctDNA是cfDNA的一部分，特指來源于腫瘤細胞的cfDNA[2]。目前針對ctDNA的檢測方法，大體分為以下幾類：突變擴增阻滯系統(ARMS)PCR、數字PCR、新一代測序(NGS)等。每一種方法都有其各自的優缺點[3]，下面將其做一具體介紹。

1.1 ARMS-PCR

ARMS是一種在PCR基礎上發展起來的檢測已知點突變的方法，也稱為等位基因特異擴增法。該法通過設計兩個5′端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純合型突變，分別加入這兩種引物及3′引物進行兩個平行PCR，需有與突變DNA完全互補的引物才可延伸并得到擴增引物，如果錯配位于3′端則導致不能衍生擴增，則稱為ARMS；該方法可以實現在同一基因中進行兩種或多種基因突變位點的檢測，屆時利用熒光定量PCR平臺實現對稀有突變檢測，達到提高檢測敏感性與特異性的目的。

目前根據ARMS原理檢測ctDNA的ADX-ARMS@EGFR試劑盒已經被國家藥監局(CFDA)批準，Cobas@ERFR也已經被確定與用來檢測EGFR的外顯子19的缺失和L858R的置換突變，相比之下dPCR和NGS還尚未得到批準；然而由于ARMS每次都只能檢測一種已知基因的突變位點，且有文獻表明不同試劑盒對ctDNA的提取結果會造成很大影響，因而在臨床上的應用也受到了一定的影響[4]。

1.2 dPCR

dPCR技術是一種新的核酸檢測方法，它包括微滴式數字PCR(ddPCR)、乳液PCR和chip-PCR。與傳統PCR不同，它的檢測優勢在于可以對單個突變基因進行絕對定量檢測。它的原理是將每一個標準的PCR反應分配至大量微滴中，以每個微滴作為一個獨立的反應器進行擴增，擴增結束后，通過熒光信號的比例和數目進行統計后計算出樣本中的拷貝數，進而實現檢測的絕對定量。

因為它的檢測優勢，使這種方法的靈敏度和特異性都明顯高于其他方法，目前有文獻表明，ddPCR是檢測EGFR突變最敏感的平臺[5]；但是由于引物位置、探針修飾等因素對結果可能造成影響，故檢測時應將這些作為結果評估的因素。

1.3 NGS

高通量測序，又名下一代測序，目前的主要檢測平臺包括三類羅氏454測序儀，Illumina公司的Solexo基因組分析儀和ABI的SOliD分析儀[6]。454測序儀原理是將PCR反應的每一個堿基的延伸和熒光信號先偶聯，通過記錄熒光信號的強弱和有無，達到實時測定序列的目的；Illumina與454測序儀的原理類似，同樣都是SBS(邊合成邊測序)，但其熒光基團直接連于堿基上；而Solid分析儀連接的序列是8個堿基的探針混合物，根據序列的順序，樣品就可以被探針標記，借此引發熒光信號的產生。NGS可以用于廣泛突變的檢測，目前對深度測序的開發也是開拓了其應用平臺，如SiRe平臺，經驗證SiRe具有較高的分析性能和0.01%的檢測限[7]。然而反應的效率和測序深度對檢測結果起到至關重要的作用，此外耗時長，成本高也限制了其在臨床上的應用。

除了上述的三種方法外，核酸質譜-色譜聯用技術(MALDI-TOF-MS)也可用于ctDNA的檢測，該技術的檢測原理是將待測樣本轉換成高速運動的離子，根據不同離子擁有的質核比(m/Z)，對基因進行檢測分析。這種方法的檢測優勢在于檢測速度快，可以對樣本進行標準化處理，缺點在于全程需要較多的手工操作，對樣本的前處理耗時可能較長[8]。

2 ctDNA在NSCLC中的臨床價值

2.1 早期診斷

有臨床證據表明，ctDNA的含量與臨床分期密切相關。但目前對癌癥早期ctDNA的檢測則成為的臨床挑戰難題。眾所周知，ctDNA占cfDNA的比例很低，故對于其早期檢測來說，富集程度和靈敏度的提高顯得尤其重要[9]。

近期發表在Nature Medicine[10]上一篇文章中提到了一種全新的ctDNA的檢查方法：癌癥個體化深度測序分析法，簡稱CAPP-Seq。該方法集合了目前對于早期ctDNA提取方法存在的問題后加以改進，首先對ctDNA進行捕獲，后進行深度測序，即完成了富集化又增加了檢測的靈敏度。結果顯示，對于Ⅱ-Ⅳ期的NSCLC檢測敏感性為100%。Ⅰ期的敏感性為50%，檢測結果發現對于比例低至0.02%的ctDNA來說也同樣能被檢測到，結果得到了ROC曲線的驗證結果為0.99和0.95，由此可見CAPP-Seq檢測的能力。這一方法的建立對肺癌早期中ctDNA的檢測有重要作用，更為ctDNA用于早期腫瘤檢測開辟了新思路。

2.2 個體化治療與耐藥性監測

對于NSCLC來說，驅動基因EGFR的突變是最常發生的事件，針對其的分子靶向藥物(主要包括酪氨酸激酶抑制劑TKI)更是治療所必需，有證據顯示接受靶向治療的患者的中位生存期為3.5年，高于非靶向治療的患者(中位生存期為2.4年)；但個體化治療后的耐藥也是靶向治療的必然結果。因此對于NSCLC來說，針對性的個體化治療與及時的耐藥性監測更是ctDNA所需要解決的重要問題[11]。

2017年5月發表在Ontarget上的有關ctDNA檢測EGRF突變一文中指出了關于運用競爭性等位基因特異性(CastPCR)的方式檢測NSCLC中的驅動突變基因的可行性[12]。此實驗收集了107名NSCLC患者的血漿樣本和與之對應的用福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織樣本進行實驗，其中以組織樣本的檢查結果作為金標準以檢測CastPCR的檢測能力。結果發現檢測出的EGFR T790M突變的靈敏性，特異性和一致性分別為54.6%(31/55),94.2%(49/52)和74.8%(80/107)；而PPV和NPV也高達91.2%(31/34)和67.1%(49/73)。該實驗方法的意義對于臨床的知道指導意義在于，對于組織不可獲取的患者來說，可選取這一方法進行篩查突變情況，如發現突變陽性可為臨床用藥起到一定的指導作用。

同時一項來自于Dana-Farber癌癥中心的研究結果顯示出微滴式數字PCR在檢測治療療效和耐藥情況的檢測結果[13]。該研究為前瞻性實驗，患者采用埃羅替尼進行治療后，觀察患者對于治療的反應情況。對使用此類藥物的患者我們進行了連續的監測后發現，在疾病出現的前幾周或幾個月，大多數患者都已出現ctDNA的分子應答和EGFR T790M的突變。后來的跟蹤隨訪發現在影像學出現改變的前16個月就可以由ctDNA發現耐藥性發生突變。

目前針對EGFR基因的突變檢測，我國也制定了《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》[14]，該指南對肺癌中EGFR基因突變和靶向治療做出了明確指示，在大樣本III期的臨床試驗中發現，EGFR基因的檢測對治療晚期NSCLC患者的意義，同時確定了EGFR基因的突變是TKIs個體化治療和耐藥性檢測的關鍵。

2.3 監測術后殘留與復發

近期的一篇文章中，針對ctDNA對非小細胞肺癌患者的預后評估能力做了研究。該文是國內首次對肺癌患者術后ctDNA檢測的報道，同時揭示了基于二代測序平臺檢測ctDNA發揮的巨大潛能[15]。該實驗選取了30例Ⅰ-Ⅱ期和11例Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者，分別采集了術前和術后的外周血和手術組織樣本。通過檢測深度大于10000x的Ion Torrent Proton平臺(其中包含了50個腫瘤用藥耐藥基因和腫瘤檢測相關的2865個熱點突變)進行深度測序。結果顯示，27對樣本中檢測到1個或者多個突變。在驅動基因EGFR、KRAS、TP53、BRAF、PIK3CA和ERBB2中檢測到tDNA和/或ctDNA突變36個。其中大多數(26/36；72.2%)突變為SNVs，其它的突變為插入或缺失(1/36和9/36)。在術前檢測到的24個突變中，術后有91.7%的突變位點的突變豐度出現了顯著下降。其中，Ia期和Ib期癌癥患者血漿ctDNA突變豐度在術后下降最多，而相對較晚期(IIa和IIIa期)的腫瘤患者血漿ctDNA突變豐度下降較少。這證實了ctDNA能夠實時敏感地反應患者的腫瘤基因突變信息和腫瘤負荷，并且可用于檢測腫瘤患者術后微小病灶殘留，評估腫瘤復發風險。

該實驗重點展示了ctDNA在檢測微小病灶及轉移復發方面的優勢，同時與傳統的腫瘤標志物相比，ctDNA更能直接反應出在治療檢測中的價值，對臨床治療的全程可以提供更明確的指導。

3 存在的問題及解決方法

3.1 如何提高ctDNA的檢出率

ctDNA在血液中的濃度多低于100 μg/L，平均約為30 μg/L。研究表明，ctDNA的含量會隨著腫瘤的進程而增加。癌癥早期或緩解期比例可低至游離DNA含量的0.01%-1%，在中晚期約占8%-10%[16]，但ctDNA提取中往往會混有其他背景DNA片段，會極大影響結果的判讀，因而ctDNA的檢出率在整個測試過程中尤其重要。

據現有文獻的報道，提高ctDNA的檢出率的方法大概可以總結為四類。前兩種方法有相似之處，均為通過推測ctDNA的來源進行更進一步的深入檢測，因為對驅動突變的針對性更強，所以檢出率會得到一定程度的提高。一種由華盛頓大學的研究人員明確，利用深度測序推測核小體模式，進而推斷不同基因的表達情況，再將其與不同細胞和組織的RNA數據庫進行比對，從而推斷具體的病變部位[17]；另一種則是通過全基因組測序，推測其原發部位的表達量。通過對基因轉錄起始點核小體的結合情況來反應轉錄狀態，間接推測基因表達量[18]。第三種方法則是基于有研究發現ctDNA比cfDNA更短[19]，因而對于腫瘤細胞來說篩選出較短片段的ctDNA對于檢測突變靈敏度更重要。第四種是糾正實驗算法，可提高檢測下限。若ctDNA本身的含量低，背景DNA會導致檢測假陽性率的上升。據統計，當等位頻率低于0.02%時，假陽性率可高達50%。針對這一問題，斯坦福大學研究團隊研究了一種iDES的算法[20]，該算法可檢測低至0.004%的突變頻率。該算法包括兩部分，一是提高ctDNA的標記技術，二是糾正算法去除背景，將錯配的堿基進行剔除。經檢測該方法的SNP錯誤率可至最低，陽性預測值可達72%，對于EGFR突變的檢測的靈敏度可達到92%，特異性達96%；而且針對不同時間點的ctDNA檢測后發現，檢測限可低至4/105，以上這四種方法大大提高了預測性與檢出率。

3.2 血液之外的體液樣本檢測

我們俗稱的體液大部分都是指血液樣本，但是對于肺組織來說，痰液無疑是其最直接的體液樣本。近期由David Wong博士率領的研究小組完成了一項研究[21]，利用EFIRM(電場誘導釋放和測量)新技術來檢測肺癌患者中EGFR基因的兩個致命突變即L858R和外顯子19缺失。該實驗選取了40例NSCLC肺癌患者的痰液樣本進行檢測，其中證明用該方法檢測到了22例NSCLC患者的EGFR突變，結果表明EFIRM檢測到外顯子19缺失的ROC面積為0.94，檢測到L858R的ROC面積為0.96。對于肺癌來說，該技術的成功為肺癌的診斷提供了一種更加無創，低成本收益和快速的檢測手段，同時也為肺癌的液體活檢開辟了一條新思路。

3.3 關于檢測的標準化問題

ctDNA的檢測相對復雜，存在多種檢測平臺，且涉及到許多方面，包括樣本的前處理、質控、提取、上機、數據分析等工作，這些對標準化來說至關重要。由于缺乏行之有效的標準化操作流程和數據分析方法，使大量數據無法整合，這使ctDNA的檢測和應用在臨床上受到了一定限制。

3.3.1質控品，標準品的制備 目前就質控品來說，有研究建議將包含突變位點的細胞系基因組DNA和重組質粒作為檢測的質控品，而它的具體制備方法和檢測限度的確定，目前還尚未統一。

近日，來自衛生部臨床檢驗中心的研究人員，建立了一種通過微球菌消化和CRISPR基因編輯技術來制備cfDNA質控品的方法[22]。研究人員通過微球菌核酸酶消化HEK293T細胞系，并用PCR定點突變和CRISPR/Cas9基因編輯技術，制備出了包含多種常見突變的質控品，并通過常用的cfDNA的常用檢測方法進行了驗證，結果可信。該實驗結果的驗證為cfDNA質控品的建立奠定了基礎，但臨床推廣還值得商榷。至少目前值得肯定的是，作為質控物和標準品的細胞系基因組DNA和重組質粒，應具備以下兩個基本特點[23]：1.質控品和標準品片段大小應與ctDNA片段大小類似2.其應包括廣泛的遺傳變異類型，如單核苷酸變異，染色體插入，缺失，異位等突變。這一點毋庸置疑。對于標準品，英國Horizon Discovery 公司研發了商品化的ctDNA標準品，它同樣來自于細胞系基因組DNA[24]。

3.3.2標準操作流程簡介 標準操作流程主要包括從血液采集到血漿運輸與儲存直至提取整個過程。類比檢驗前、檢驗中和檢驗后三個程序來說，檢驗前的標本合格與否，會直接影響最終的檢測結果。目前推薦的標本前處理方案大致如下：采用cfDNA專用常溫采血管進行血液采集(在采血過程中盡量避免血液回流，建議采血約10 ml后顛倒混勻)，保證血液質量無誤后立即送檢；離心(建議1600*g，10 min)，收集血漿層，再離心后分裝。而后進行cfDNA的提取，目前建議采用上述提到的Cobas DNA Sample Preparation Kit試劑盒進行提取，后用TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒進行熒光定量檢測，但目前這只是理想化的提取方法，具體操作步驟的制定，還沒有明確操作指南。

3.4 檢測平臺的合理利用

3.4.1dPCR 耐藥性的突變的確定是ctDNA能否向臨床實驗室轉化的關鍵。近日有研究者對常見檢測平臺進行比較分析后得知：dPCR對于耐藥性檢測是最適合的檢測方法。近日，阿斯利康公司研究團隊對血漿ctDNAd EGFR突變進行了多個檢測平臺的比較后發現，COBAS EGFR突變檢測法和數字PCR中的BEAMing dPCR技術對于監測耐藥，表現出高敏感度(78%-100%)和高特異性(93%-100%)。研究者們先用38例樣本進行評估，發現對于常見的T790M突變來說，數字平臺(71%)明顯優于非數字平臺(29-41%)。而后增加至72例后進行血漿樣本的評估，發現前者的特異性和敏感性分別為73%和67%；后者為81%和58%；以上結果表明對于耐藥性的突變檢測來說，這兩種方法與其他檢測方法相比，較為敏感和特異[25]。

3.4.2NGS 雖然dPCR在檢測耐藥性方面優勢明顯，但由于dPCR尚未得到合理審批，相比之下，NGS在北京，上海，浙江等地的貝瑞和康創新技術已經通過《國家衛生計生委醫政醫改局關于腫瘤診斷與治療項目高通量測序技術臨床應用試點工作的通知》；此外對于非T790M基因突變的肺癌患者來說，NGS檢測則顯得更加意義明確。同時臨床上對于精準、全面、統一，價格相對低廉的多基因檢測需求更是推動了NGS的發展。 有文獻指出，全基因組測序NGS不僅可以篩選突變，還可以篩選出重排和拷貝數畸變，并提供個體遺傳基因組調查結果。如上述提到的CAPP-Seq，則可以識別超過95%的腫瘤中的突變。除了確定突變特征之外，還測序可提供個性化治療，跟蹤突變載荷和抗性機制的發生。由于了解整個分子的組成才能使我們能夠選擇最佳治療方案，這樣看來，NGS似乎是臨床應用時最適合的檢測技術[26]。

同時有學者連續對晚期非小細胞肺癌患者102名獲得的112名血漿樣品進行前瞻性研究，發現高達70個基因的超深度測序與組織樣本匹配。在45個基因中檢測到275個突變，102個患者中86個的ctDNA中至少有一個改變患者(84%)，其中EGFR變異最常見。 ctDNA NGS檢測到50個驅動和12個抗性基因和22個其他基因的突變。 而連續102例患者完成ctDNA NGS，組織測序僅為50名患者成功(49%)。 在24個組織和19個ctDNA中檢測到可行的EGFR突變樣品，產生79%的一致性，且發現組織和采血之間的時間間隔更短，一致性越高。此實驗用數據充分證明 ctDNA NGS的臨床應用價值[27]。

3.4.3數據的處理與分析 2016年4月23日，中國臨床腫瘤學會(CSCO)和中國腫瘤驅動基因分析聯盟(CAGC)聯合發布了《二代測序(NGS)技術應用于臨床腫瘤精準醫學診斷的共識》。該共識對信息學分析提出了要求，具體如下：生物信息學流程必須針對所使用的技術平臺；任何化學成分的改變、濃縮方法或生物信息學分析平臺應該保證后續的有效性；診斷實驗室必須驗證所有的生物信息學流程(公用工具或商業軟件包)的標準信息設置，以確保相關數據更改后(新版本)及時跟進，診斷實驗室應使用當前注釋相關變異體的結構化數據庫。該共識意見對生物信息學方法做出了具體要求，對ctDNA的數據分析和處理起到了更加明確的指示作用。

3.5 尚未解決的問題與思考

3.5.1ctDNA含量與分期 分期對于腫瘤的診治尤為重要，目前我們還停留在ctDNA檢測的起跑線上。對ctDNA的定量檢測后，是否可以實現這兩者的相關性研究，這路途還很遙遠。同時這也是實現ctDNA能否向臨床轉化的關鍵。可以設想未來如果可以通過對ctDNA的絕對定量檢測從而實現對腫瘤的分期，甚至可以實現確定哪個范圍為用藥人員，哪個范圍為手術人員，這對于早日實現“精準醫療”是有所裨益的。

3.5.2對ctDNA檢測人員的規范化培訓 由于ctDNA本身含量少，豐度低。因而精準提取對于檢測結果來說顯得至關重要。建議應定向培養專業的檢測技術人員對標本進行完好的處理(其中最重要的是降噪處理)來有效避免人為因素導致的檢測誤差；此外還包括定價問題。正如現在的檢驗項目一樣，不同的檢測方法，試劑耗材會有所差異，對于不同的ctDNA檢測方法，也應采取不一樣的收費標準，對于患者來說，這也更加合理。

結語

對于NSCLC來說，液體活檢正發揮著巨大的潛能。針對液體活檢中的ctDNA，其各自提取和檢測方法的不足之處還有待完善；針對NSCLC的早期診斷，個體化治療及耐藥性監測，甚至包括預后復發評估的意義也將伴隨著提取和檢測方法的改進而更加意義明確。但是對于檢測后的數據統計分析方面，目前我們了解的還甚少，故建議將這一部分作為以后的研究熱點。同標準化一樣，盡早制定出相對完善的共識意見；此外其他液體活檢的研究還方興未艾，探討它們的聯合檢測的意義，任重而道遠。

[1]沈曉燕，章 抗，楊 楊，等.液體活檢在非小細胞肺癌中的應用[J].現代腫瘤醫學,2017,25(01):160.

[2]瞿國英,郁愛平．外周血游離 DNA作為腫瘤標志物的臨床展望和生物學意義[J].國際檢驗醫學雜志,2016，37(9):1234.

[3]Xu Ting,Kang XZ,You XF，et al.Cross-Platform Comparison of Four Leading Technologies for Detecting EGFR Mutations in Circulating Tumor DNA from Non-Small Cell Lung Carcinoma Patient Plasma[J].Theranostics,2017,7:1437.

[4]Kwapisz D,The first liquid biopsy test approved.Is it a new era of mutation testing for non-small cell lung cancer[J]?Annals of Translational Medicine,2017,5:46.

[5]Suzawa K,Yamamoto H,Ohashi K,et al.Optimal method for quantitative detection of plasma EGFR T790M mutation using droplet digital PCR system[J].Oncology Reports,2017,37:3100.

[6]Goodwin S,McPherson JD，McCombie WR,et al.Coming of age:ten years of next-generation sequencing technologies[J].Nature,2016,17:333.

[7]Malapelle,Umberto MD,Clara R,et al.Development of a gene panel for next generation sequencing of clinically relevant mutations in cell-free DNA from cancer patients[J].British Journal of Cancer,2017,116:802.

[8]Masters GA,Krilov L,Bailey HH,et al.Clinical Cancer Advances 2015:Annual Report on Progress Against CancerFrom the American Society of Clinical Oncology[J].Journal of Clinical Oncology,2015,33:786.

[9]Perez RC,Canadas GM,Robles AI,et al.Liquid biopsy in early stage lung cance[J].Transl Lung Cancer,2016,5:517.

[10]Newman MA,Bratman SV,To J,et al.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J].Nature Medicine,2014,20:548.

[11]Kasahara N，Kenmotsua H,Serizawa M,et al.Plasma epidermal growth factor receptor mutation testing with a chip-based digital PCR system in patients with advanced non-small cell lung cancer[J].Elsevier Lung Cancer,2017,106:138.

[12]Yang Y,Shen X,Li R,et al.The detection and significance of EGFR and BRAF in cell-free DNA of peripheral blood in NSCLC[J].Oncotarget,2017,8:49773.

[13]Oxnard GR,Paweletz CP,Kuang Y,et al.Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J].Clin Cancer,2014,20:1698.

[14]《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制，非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識．非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識[J].中華醫學雜志，2015,95(46)：3721.

[15]Guo N N,Lou Feng,Ma Y.et al.Circulating tumor DNA detection in lung cancer patients before and after surgery[J].Scientific Reports,2016,6:33519.

[16]Holdhoff M,Schmidt K,Donehower R,et al.Analysis of Circulating Tumor DNA to Confirm Somatic KRAS Mutation[J].Natl Cancer Inst,2009,101:1284.

[17]Snyder MW,Kircher M,Hill AJ,et al.Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin[J].Cell,2016,164:57.

[18]Ulz P,Thallinger GG,Auer M,et al.Inferring expressed genes by whole-genome sequencing of plasma DNA[J].Nature Genetics,2016,48:1273.

[19]Underhill HR,Kitzman JO,Hellwig S,et al.Fragment Length of Circulating Tumor DNA[J].PLOS Genetics,2016,12:e1006162.

[20]Newman AM,Lovejoy AF,Klass DM,et al.Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA[J].Nature biotechnology,2016,34:547.

[21]Fang Wei,Lin Chien-Chung,Joon A,et al.Noninvasive Saliva-based EGFR Gene Mutation Detection in Patients with Lung Cancer[J].Care Med,2014,190:1117.

[22]Tsang JC,Chan KC.Quality Materials for Quality Assurance in the Analysis of Liquid Biopsy Samples[J].ClinChem,2017,63:1431.

[23]Zhang R,Peng Rong,Li Z,et al.Synthetic Circulating Cell-free DNA as Quality Control Materials for Somatic Mutation Detection in Liquid Biopsy for Cancer[J].Clin Chem,2017,63:1465.

[24]徐 婷，徐國賓,賈淑芹，等.循環腫瘤DNA檢測在惡性腫瘤診治中的應用進展與問題思考[J].臨床檢驗雜志,2016，35(2)：81.

[25]Xu Ting,Kang XZ,You XF，et al.Cross-Platform Comparison of Four Leading Technologies for Detecting EGFR Mutations in Circulating Tumor DNA from Non-Small Cell Lung Carcinoma Patient Plasma[J].Theranostics,2017,7:1437.

[26]Gu J，Zang W,Liu B,et al.Evaluation of digital PCR for detecting low-level EGFR mutations in advanced lung adenocarcinoma patients:A cross-platform comparison study[J].Oncotarget,2017,8:67810.

[27]Thompson JC,Yee SS,Troxel AB,et al.Detection of therapeutically targetable driver and resistance mutations in lung cancer patients by next generation sequencing of cell-free circulating tumor DNA[J].Clin Cancer,2016,22:5772.