NGAL及NGALR在腎臟纖維化進程中的作用

王瑞芳,尹 敏,范 卉,李倩玉,劉 鋒

(吉林大學中日聯誼醫院 腎內科,吉林 長春130033)

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)是Kjeldsen等[1]1993年研究人類中性粒細胞時首先發現,它與92 kD的明膠酶-B即基質金屬蛋白酶9(MMP-9)密切相關,是一個分子量只有25 kD的分泌型糖蛋白。大量研究發現,急性腎損傷(AKI)早期NGAL水平即迅速升高,與腎臟損傷分子(KIM-1)、血肌酐(Scr)、尿N-乙酰葡萄糖苷酶(NAG)等AKI標志物相比優勢明顯,具有快速、靈敏、特異等生物學特點,可作為早期檢測AKI的生物學標志物,并對腎臟有保護作用。但NGAL是否在慢性腎臟病(CKD)進程中也發揮一些作用目前還無明確系統闡述。目前研究發現了NGAL在糖尿病腎病[2]、腎病綜合征[3]、狼瘡性腎炎[4]、IgA腎病[5]、多囊腎[6]等多種CKD疾病進展中表達。近年來有實驗研究NGAL及NGALR在腎臟纖維化進程中所發揮的作用,本文就此相關研究進展作一綜述。

1 NGAL及其受體NGALR

NGAL：NGAL也被稱作24p3、Lipocalin2(Lcn2)、Siderocalin、NRL或SIP24等,屬于Lipocalin家族,可能與炎癥反應、免疫調節、細胞分化、細胞凋亡、腫瘤發生發展等有密切關系。生理條件下NGAL少量表達于骨髓中性粒細胞,且只在中幼粒及晚幼粒細胞階段合成。NGAL也表達于人體很多組織中,在前列腺、肝臟、胃、結腸、乳腺等以低水平表達,而在腦和周圍神經等組織細胞中表達呈陰性[7]。缺血、腎損傷、炎癥、感染等因素能上調NGAL的表達[7],NGAL可在其他組織中大量生成。正常情況下NGAL在腎組織呈低表達狀態,大量研究證實主要在近端小管表達,同時也存在于遠端腎單位。有研究[8]發現了24p3樣大鼠同源物α2μGRP于大鼠腎小球系膜細胞(MC)表達。Lee等[9]研究證明了小鼠足細胞表達Lcn2/NGAL,IL-6能激活足細胞Lcn2/NGAL的表達。而受缺血性損傷的小鼠腎臟中NGAL還可典型地表達于致密斑[10]。NGAL調控腎小管上皮細胞的凋亡,當上皮細胞受到刺激時,受損的遠端腎小管、集合管分泌NGAL增強,且表達量與腎小管的損傷程度密切相關[10],誘導增殖浸潤的中性粒細胞發生凋亡,以免腎組織受到炎細胞侵害。NGAL能夠結合一些配體,其中最重要的是鐵載體,其它還包括MMP-9、肝細胞生長因子(HGF)及蛋白激酶等。

NGALR：Devireddy等[11]在鼠淋巴細胞系來源的FL5.12細胞中發現24p3的特異性細胞表面受體24p3R,并找到相對應的人類同源物NGAL受體,NGALR。目前已經明確的NGAL受體,一種是NGALR選擇性剪接變異體NGALR1,即megalin受體(NM_020372),低分子密度脂蛋白受體家族的一員,為NGAL非特異性蛋白結合體[12],是介導多配體內吞的單跨膜受體。另一種是NGALR2,它是高度保守的24p3R人同源物(NM_016609),腦型有機陽離子轉運蛋白家族的一員,與NGAL特異結合[11]。2007年Fang等[13]在分析食管癌細胞系中NGAL受體的表達時,確定了一種新的1438bp較短的cDNA片段,NGALR3(DQ_658848)。有研究發現[14]NGALR在人腎臟的近曲小管上皮強陽性表達,腎單位的其它部分與腎小球為中等陽性表達。之后有學者[15]證實了NGALR在人腎小球的表達區域主要分布在系膜細胞上,NGAL可通過與NGALR結合進入系膜細胞。NGALR陽性表達于細胞膜或細胞質。24p3-24p3R介導鐵轉運途徑,結合了鐵的24p3通過24p3R的胞吞作用進入細胞,調節細胞內鐵水平變化,起到保護腎臟、調控細胞凋亡的作用。24p3R還介導遠端腎單位上皮細胞鐵螯合,發揮抑菌作用。

2 NGAL及NGALR和腎臟纖維化

腎臟纖維化是各種CKD進展到終末期腎病的共同通路,包括腎小球硬化和腎間質纖維化(RIF)。其主要病理改變表現為腎間質成纖維細胞增生和細胞外基質(ECM)在腎間質中過度積聚。腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化(EMT)是導致RIF發生的核心病理過程。腎小管上皮細胞可通過EMT轉分化為肌成纖維細胞,進入間質,合成ECM,而阻斷EMT可以抑制RIF進程。受損傷腎臟主要的促纖維化細胞為腎小球MC、間質成纖維細胞和腎小管上皮細胞[16]。損傷刺激引起腎臟固有細胞活化,釋放大量趨化因子,如單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、調節活化正常T細胞分泌因子(RANTE)等,吸引循環中炎性細胞浸潤到損傷部位,產生有害分子,上述物質又刺激促纖維化細胞表型的活化或轉變,從而產生大量的ECM。NGAL可通過與NGALR結合進入細胞而發揮生物學作用,NGAL的功能受到NGALR表達抑制的直接影響,因此NGALR的表達對研究NGAL在慢性腎臟疾病中的生物學意義也是非常重要的。近年來研究表明,NGAL及NGALR可通過不同的信號通路或途徑調節纖維化相關因子的表達水平,從而參與腎小球硬化和RIF。NGAL及NGALR可能通過以下的幾個方面參與腎臟纖維化的發病過程。

2.1 NGAL和MMP-9

基質金屬蛋白酶家族(MMPs)能夠降解ECM和腎小球基底膜(GBM),組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)能夠與特異MMPs家族成員結合形成MMPs-TIMP復合體抑制其活性,從而控制ECM的降解、組織重塑等。NGAL是在研究MMP-9時被發現的,它是活化的中性粒細胞中釋放的多功能蛋白,通過二硫鍵與MMP-9結合形成復合物,以此調節MMP-9的活性,并保護MMP-9不被降解。有研究顯示[17],在單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎臟NGAL表達陽性程度與腎小管間質損傷指數及MMP-9始終呈顯著正相關,提示NGAL可能與MMP-9在UUO大鼠腎臟中作用相似。MMP-9在腎小球高度表達,主要降解IV型膠原(Col)和明膠。MMP-9可使ColIV釋放可溶性羥脯氨酸,降解完整的GBM,MMP-9活性水平直接影響ColIV的表達和局部沉積,調節腎臟纖維化的過程。TIMP-1為MMP-9的特異抑制劑,MMP-9/TIMP-1是參與ECM降解的重要酶系,而NGAL同MMP-9和TIMP-1形成三元復合物,某種程度上來說,NGAL可抵消復合物中TIMP-1對MMP-9的活性抑制作用,從而抑制腎臟纖維化。

2.2 NGAL及NGALR和NF-κB

核因子κB(NF-κB)可以調控多種炎性因子和趨化因子的表達,參與成纖維細胞的增殖分化、ECM交聯及細胞凋亡等過程。IκB為NF-κB的抑制蛋白,而IκBζ是非典型的IκB蛋白的其中一種。序列分析發現,在NGAL基因5'側翼轉錄調控區有典型的轉錄激活因子NF-κB的結合元件。Iannetti等[18]研究發現,在衍生自人未分化甲狀腺癌細胞(FRO細胞)中,IκBζ和NF-κB的p50及p52亞基一起結合于NGAL的啟動子,激活NGAL,NF-κB通過誘導因子IκBζ調控NGAL的表達。在人結直腸癌細胞系中研究發現[19],Lcn2高表達與NF-κB的表達呈負相關,Lcn2可抑制NF-κB向核內轉運。Lcn2作用于NF-κB/snail信號通路的上游,可通過減弱NF-κB的啟動子活性而顯著抑制NF-κB/snail信號通路誘導的EMT。在腎臟中,NF-κB通路激活后可通過誘導炎癥反應直接參與EMT、RIF,由此推測NGAL在腎臟中可能也是腎小管EMT重要的負調控因子。還有研究發現[20],高糖可激活大鼠腎小球MC中Toll樣受體-4(TLR4)/NF-κB p65通路,上調NGAL mRNA及蛋白表達,同時伴有炎癥因子[MCP-1、趨化因子配體5(CXCL5)]及纖維化因子[纖連蛋白(FN)、結締組織生長因子(CTGF)]表達水平升高,參與腎臟炎癥反應及纖維化改變。Langelueddecke等[21]研究證明,24p3R可以介導蛋白質內吞,特別是白蛋白。發生蛋白尿時,異常增多的血漿蛋白競爭結合NGALR,NGALR介導蛋白細胞內吞,遠端腎單位接觸高濃度白蛋白,隨后激活NF-κB通路,誘導TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IκBα和RANTES表達水平增加,參與進一步相關反應[22]。

2.3 NGAL及NGALR和TGF-β1

轉化生長因子-β1(TGF-β1)能引起腎小管EMT,是致腎臟纖維化的重要生長因子,過度表達可使腎組織ECM過度積聚。TGF-β1對ECM的影響機制主要有：①通過TGF-β1/Smad信號傳導通路,增加MC增殖和ECM分泌,這在腎臟纖維化中起核心作用。②抑制MMPs活性,減少ECM的降解。有研究顯示[18],在UUO大鼠腎臟NGAL水平與腎小管間質損傷程度及TGF-β1表達程度在RIF過程早期階段(術后3-7 d)呈明顯正相關,在晚期階段 (術后14-28 d)呈顯著負相關,提示NGAL與TGF-β1致纖維化的作用關系密切。有體外研究[23]發現,在分別用0,1,5,10和20 ng/ml的TGF-β1處理正常大鼠近端腎小管上皮細胞系(NRK-52E),NGAL mRNA的表達水平隨TGF-β1的濃度上升而下降,且在5和10 ng/ml時變化最顯著,而用抗TGF-β1抗體中和后,NGAL mRNA的表達恢復到控制水平(0 ng/ml)。由此可推測,TGF-β1可以抑制NGAL的表達,從而參與腎臟纖維化,相反NGAL具有一定的抑制腎臟纖維化的作用。TGF-β1還參與下調24p3R表達,減少腎小管的蛋白負荷,當24p3R表達受抑制后,TGF-β1、鋅指轉錄因子(Snail)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SAM )mRNA的表達在24p3R缺失細胞中明顯減少[22]。

2.4 NGAL及NGALR和Ras-MAPK、MAPK/ERK

鈣依賴性跨膜糖蛋白( E-cad)廣泛存在于機體上皮組織,介導同種細胞間相互黏附,有助于維持正常上皮細胞形態和組織結構完整性。Yang[24]等通過小鼠實驗,將表達24p3的輸尿管芽細胞處理分離,推斷NGAL通過增強E-cad表達,阻止RIF。Ras誘導多個下游效應,它可激活絲/蘇氨酸蛋白激酶(Raf),繼而激活絲裂原細胞外激酶(MEK),導致絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化,同時Ras還可介導其他信號傳導通路。Jun-ichi Hanai等[25]研究發現,在同基因型自發遷移乳腺癌模型細胞(4T1細胞)中,使用純化的NGAL作用于R細胞(4T1-Ras細胞),Ras誘導的Raf、MEK和胞外信號調控激酶(ERK)1/2磷酸化消失了,但Ras總的表達水平不變,同時還發現NGAL作用于MEK的上游區,說明NGAL可以調節Ras-MAPK途徑,且作用位點在Ras和Raf之間。此外,NGAL干預Ras-MAPK之外的信號通路不足以抑制Ras誘導的EMT,進一步證明NGAL可以通過Ras-MAPK信號通路抑制Ras誘導的EMT。研究還發現,Ras-MEK是EMT必不可少的,MEK活化是EMT的關鍵,它促進E-cad磷酸化和降解,MEK抑制劑和NGAL可以抑制Ras誘導的EMT,明顯減少E-cad磷酸化,同時提高E-cad蛋白的表達水平。而在這過程中,NGAL既不影響E-cad mRNA的水平,也不增強E-cad啟動子的轉錄活性,表明這一過程是通過轉錄后效應實現的。Mao等[16]體外實驗研究結果證明,IL-1β通過激活MAPK/ERK通路上調人系膜細胞(HMC)的NGALR表達,且這種升高可以被ERK的活性抑制劑所抑制。同時在HMC中能檢測到NGAL mRNA的表達,但無蛋白翻譯,并且IL-1β能誘導NGAL mRNA表達增加。但加入外源性NGAL后,則能在HMC中檢測到NGAL蛋白的表達。NGAL通過NGALR被攝入MC內,誘導HMC上調FN、ColIV和CTGF的表達水平,參與腎臟纖維化。

2.5 NGAL和HGF

在腎臟中,HGF由腎小球MC、內皮細胞及間質成纖維細胞等間質來源的細胞生成。HGF主要通過抑制TGF-β1的產生或阻斷TGF-β1/Smad通路負性調控EMT,是一種重要的抗纖維化因子。有研究[26]發現,在小鼠腎臟內髓集合管-3細胞(mIMCD-3細胞),HGF可以刺激上皮細胞表達NGAL增加。而分泌的NGAL可以直接與HGF結合,降低HGF與其受體c-Met結合的能力,減少下游信號活化,顯著抑制HGF刺激腎小管上皮細胞過度遷移和分化的能力。還有實驗研究發現[27],采用UUO致RIF的大鼠模型,腎臟損傷后HGF和NGAL都于早期表達升高,RIF形成后兩者表達下降,NGAL與HGF的水平呈正相關。而促肝細胞生長素(pHGF)能使腎組織中HGF的表達增加,維持E-cad的表達,并促進NGAL的表達,減輕UUO大鼠RIF的程度。二者在腎臟損傷修復過程中協同抑制RIF。

NGAL主要在近端腎小管表達,也有實驗發現了NGAL的同源物表達于系膜細胞、足細胞、致密斑,NGALR在腎小球的表達區域主要分布在MC上,NGAL可與NGALR結合進入MC而發揮生物學作用。在腎臟纖維化進程中,NGAL可以抑制促纖維化因子的表達,提高抗纖維化蛋白的活性,從而一定程度上抑制腎臟纖維化,起到對腎臟的保護作用。從NGAL著手,或許有益于研制促進NGAL活性或表達的藥物,從而延緩腎臟纖維化的進展,達到治療慢性腎臟病的目的。但腎臟纖維化過程涉及到很多細胞、ECM、細胞因子等的參與,各種因素相互作用及調控,還需要進一步研究。

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