樺褐孔菌多糖的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性評價

王晶波，楊 倬，劉婷婷，沈 葹，陳 曦，秦 文，王麗媛，萬麗葵

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京 100050)

樺褐孔菌主要分布于俄羅斯北部、北歐、中國黑龍江、吉林長白山、日本北海道等北緯40°～50°地區(qū)，是東歐、俄羅斯、波蘭、芬蘭等民間廣泛利用的一種叫“chaga”的藥用真菌來防治各種疑難雜癥[1-2]。多糖是樺褐孔菌重要的活性成分，具有抗氧化[3-4]、抗腫瘤[5]、抗菌[6]、抗病毒[7]、降血糖[8]、降血脂[9]、抗突變[10]、抗哮喘[11]、增強免疫力等多種生物活性。這些功能的發(fā)揮與其抗氧化活性密不可分，因此相關(guān)領(lǐng)域的研究主要集中在其抗氧化活性。

真菌多糖的提取方法有多種，包括水提醇沉法、超聲提取法、堿提法、酶提法、微波提取法、超濾法等[12]，提取方法常受提取時間、溫度、pH值、料液比、提取次數(shù)等因素的影響，使得多糖提取率的高低不同，耗費的時間、物力以及成本也不同。水提醇沉法是最常用的真菌多糖提取方法，它操作簡單，但存在著損失大、周期長、提取率不高等缺點。超聲波技術(shù)作為一種有效的提取方法，可大大縮短提取時間，提高提取效率，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取研究[13]。目前，樺褐孔菌多糖超聲波法的研究比較少，還需要進一步的深入探索。

本研究以多糖提取率為指標(biāo)，先采用單因素試驗確定超聲波法提取樺褐孔菌多糖的因素和水平，再采用正交試驗法確定超聲波法的最佳提取工藝，同時還對比了不同產(chǎn)地的樺褐孔菌多糖提取率和抗氧化能力，證實超聲波法未破壞樺褐孔菌多糖的生物活性。為日后樺褐孔菌多糖的分離純化和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，為樺褐孔菌多糖的功能性研究提供便利條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(GBW10062)，購自中國計量科學(xué)研究院國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

樺褐孔菌樣品(市售)，分別購自俄羅斯、吉林樺甸、黑龍江大興安嶺、吉林白山和云南香格里拉。無水乙醇、硫酸，北京化工廠生產(chǎn)。苯酚，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。試劑均為分析純。

總抗氧化能力和羥自由基清除能力測定試劑盒，購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

紫外可見分光光度計U-3900，購自日本日立公司；離心機eppendorf Centrifuge 5810R，購自艾本德中國有限公司；電熱恒溫水槽DK-450B型和電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DGG-9240B型，購自上海森信實驗儀器有限公司；電子天平METTLER TOLEDO-ME403E，購自梅特勒-托利多儀器有限公司；康士潔牌數(shù)碼超聲波清洗機PL-S30(功率180w，頻率40000Hz)，購自深圳市宸韻佳貿(mào)易有限公司；酶標(biāo)儀synergyH1 5300，購自基因有限公司。

1.2 粗多糖含量檢測

采用苯酚-硫酸分光光度測定法，此法是一種使用性廣、精確度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好的測定真菌多糖的方法[14]。

原理：多糖經(jīng)乙醇沉淀分離后，去除其他可溶性糖及雜質(zhì)的干擾，在硫酸作用下，先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚反應(yīng)生成橙黃色溶液，其呈色強度與溶液中糖的濃度成正比，在490nm處有特征吸收[15]。

1.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精確稱取干燥恒重的葡萄糖0.100 0g，加水溶解定容至1 000mL的容量瓶中，混勻備用。此溶液為質(zhì)量濃度100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于比色管中，各補水至1mL，然后加入1.0mL 5%的苯酚溶液，振蕩混勻。再小心快速加入5.0mL硫酸，用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，靜置10min，然后置30℃水浴中反應(yīng)20min，490nm處測定吸光度值。以試劑空白為參比，測定吸光度值，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2樣品測定 將粗多糖樣品溶于蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至容量瓶定容。量取樣品溶液1.0mL置于比色管中，然后按照1.2.1方法操作，測定490nm處吸光度值。如若超出標(biāo)準(zhǔn)曲線測定范圍，則將樣品溶液按比例稀釋再進行測定。

1.2.3結(jié)果計算 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品溶液中含糖量m1(μg)，樺褐孔菌粉末取樣量m2(g)(本試驗m2均為1g)，樣品定容的體積為V(mL)，0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)，根據(jù)式(1)計算出多糖提取率，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)W計，單位以克每百克(g/100g)表示，計算公式為式(1)：

(1)

1.3 超聲波法提取樺褐孔菌粗多糖工藝流程

1.4 超聲波法提取樺褐孔菌粗多糖工藝單因素試驗

1.4.1不同超聲時間對粗多糖提取的影響 稱取7份1g樺褐孔菌粉末，按照料液比1∶30加入蒸餾水，分別60℃超聲5、10、15、20、25、30、40min后離心吸取上清液，加入無水乙醇至終濃度70%沉淀多糖，每樣重復(fù)3次，測定多糖提取率(圖1)。

1.4.2不同料液比對粗多糖提取的影響 稱取5份1g樺褐孔菌粉末，分別按照料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60加入蒸餾水(1∶10液體太少，無法分離上清)，60℃超聲25 min后離心吸取上清液，加入無水乙醇至終濃度70%沉淀多糖，每樣重復(fù)3次，測定多糖提取率(圖2)。

1.4.3不同超聲溫度對粗多糖提取的影響 稱取6 份1 g樺褐孔菌粉末，按照料液比1∶30加入蒸餾水，分別20、30、40、50、60、70℃超聲25 min后離心吸取上清液，加入無水乙醇至終濃度70%沉淀多糖，每樣重復(fù)3次，測定多糖提取率(圖3)。

1.5 超聲波法提取樺褐孔菌粗多糖工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取超聲時間(A)、料液比(B)和超聲溫度(C)這3個因素，采用L9(34)進行正交試驗(表1)。

表1 超聲波法試驗因素水平

1.6 超聲波法與水提醇沉法提取粗多糖的對比試驗

水提醇沉法采用料液比1∶40、加熱溫度80℃、加熱時間2.25h、沉淀多糖的乙醇終濃度70%。超聲波法按照最佳提取條件提取多糖。兩種方法均重復(fù)提取1～3次，綜合提取得到的多糖，對比多糖提取率。

1.7 不同產(chǎn)地的樺褐孔菌粉末多糖提取率和抗氧化能力檢測

1.7.1多糖提取率檢測 稱量不同產(chǎn)地的樺褐孔菌粉末各1 g，按照超聲波法最佳提取條件提取多糖，測定多糖提取率。

1.7.2抗氧化能力檢測 按照試劑盒說明書操作，采用同1.2.2相同的樣品試驗，根據(jù)公式求得總抗氧化能力和羥自由基清除能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

在490nm處測定吸光度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.004 6X+0.046 3，R2=0.999。

2.2 單因素試驗結(jié)果

從圖1～3可以看出，隨著超聲時間、料液比和超聲溫度的增加，多糖提取率變化比較規(guī)則，均為先增加后減少，在超聲時間為25min、料液比為1∶30和超聲溫度60℃時達(dá)到最大，因此，超聲時間25min、料液比1∶30、超聲溫度60℃為最佳工藝參數(shù)。

圖1 超聲時間對多糖提取率的影響

圖2 料液比對多糖提取率的影響

圖3 超聲溫度對多糖提取率的影響

2.3 超聲波法的正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以超聲時間(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)3個因素進行樺褐孔菌多糖提取的正交試驗。從表2可以看出，處理組合A2B3C1的多糖提取率最高，為4.59 g/100g。通過極差分析，超聲提取法提取多糖的影響因素中A>B>C，即影響因素由大到小為超聲時間、料液比和超聲溫度，最佳組合為A2B3C1，與實驗中多糖提取率最高組合相同，故樺褐孔菌多糖的超聲提取法最佳提取條件為A2B3C1，即超聲時間25min、料液比1∶40、超聲溫度50℃。

表2 超聲波法正交試驗結(jié)果

2.4 超聲波法與水提醇沉法對比試驗結(jié)果

表3結(jié)果表明，超聲波法采用超聲時間25min、料液比1∶40、超聲溫度50℃的提取條件下，對樺褐孔菌樣品提取3次，多糖提取率高達(dá)8.61g/100g，與水提醇沉法相比提高了17.3%，耗時僅用了2h，用時縮短了3/4，有效提高了樺褐孔菌多糖的提取率。

表3 超聲波法和水提醇沉法對比結(jié)果

2.5 不同產(chǎn)地的樺褐孔菌多糖提取率和抗氧化能力檢測

表4可以看出，采用超聲波法提取得到的樺褐孔菌多糖均具有抗氧化能力，此種超聲波法未破環(huán)多糖的生物活性。對不同產(chǎn)地樺褐孔菌的多糖提取率與總抗氧化能力和羥自由基清除能力進行相關(guān)性分析。由表5可知，抗氧化能力與多糖提取率之間的相關(guān)性極顯著，多糖提取率越高，抗氧化能力越強。其中，產(chǎn)地云南和俄羅斯的樣品多糖提取率最高，云南略高于俄羅斯，抗氧化能力則為產(chǎn)地俄羅斯的樣品最高。

表4 不同產(chǎn)地的樺褐孔菌多糖提取率和抗氧化能力檢測結(jié)果

表5 多糖提取率與抗氧化能力相關(guān)性分析

3 結(jié)論

超聲提取法提取主要是利用超聲波空化產(chǎn)生的極大壓力造成被破碎物細(xì)胞壁及整個生物體瞬間破裂，同時超聲波產(chǎn)生振動作用加強了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散及溶解，加速植物中的有效成分進入溶劑，使其進一步增大了有效成分進入溶劑。所用儀器簡單，操作方便，超聲波儀自動化程度較高，便于大規(guī)模生產(chǎn)[16]。

本研究采用正交法確定了超聲波法提取樺褐孔菌多糖的最佳工藝條件為超聲時間25min、料液比1∶40、超聲溫度50℃、提取3次，對比了超聲波法和水提醇沉法提取樺褐孔菌多糖的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲波法的多糖提取率高達(dá)8.61g/100g，與水提醇沉法相比提高了17.3%，耗時縮短了3/4，大大提高了提取效率。同時超聲波法在提取過程無需高溫，避免高溫對樺褐孔菌多糖分子的結(jié)構(gòu)破壞，能夠有效地提取多糖，保持多糖的活性。另外，對比了來源于5個不同地區(qū)的樺褐孔菌干粉的多糖提取率和抗氧化能力，結(jié)果表明，抗氧化能力與多糖提取率之間的相關(guān)性極顯著，多糖提取率越高，抗氧化能力越強，產(chǎn)地云南和俄羅斯的樣品在多糖提取率和抗氧化能力方面差異不大。

綜上所述，通過優(yōu)化提取條件，超聲波法提高了樺褐孔菌多糖提取量，未破壞多糖的生物活性，是一種可行、實用和高效的食用菌多糖提取方法，可以在真菌多糖的工業(yè)化生產(chǎn)積極推廣應(yīng)用，為今后對樺褐孔菌的進一步開發(fā)利用和功能研究提供參考。◇

[1]林碧賢，李曄，毛景華，等.藥用真菌白樺茸：樺褐孔菌[J].海峽藥學(xué)，2004，16(6)：74-76.

[2]黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌：樺褐孔菌[J].中國食用菌，2002，21(4)：7-8.

[3]吳艷玲，南極星.樺褐孔菌多糖對小鼠抗氧化清除自由基作用的研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009(12)：9-10.

[4]回晶.樺褐孔菌多糖的體外抗氧化作用研究[J].食用菌學(xué)報，2006，13(2)：29-35.

[5]陳義勇，顧小紅，湯堅.樺褐孔菌多糖的抗腫瘤活性研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2011(1)：65-69.

[6]路源，李建光，孟楠，等.樺褐孔菌多糖涂膜對蘋果保鮮效果的研究[J].食品與機械，2011(4)：133-135.

[7]蔣月，盛鵬飛，張玲.樺褐孔菌多糖的提取及體外抗新城疫病毒活性試驗[J].中國家禽，2014(1)：47-50.

[8]高愿軍，張家泉，王娟娟，等.樺褐孔菌多糖口服液降血糖作用研究[J].食品科技，2010(7)：93-95.

[9]崔鶴松，金光.樺褐孔菌多糖對實驗性高脂血癥模型大鼠血脂的影響[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報，2007(3)：173-174.

[10]李雪，金乾坤，李曉東，等.長白山野生食用菌多糖抗突變作用的研究[J].營養(yǎng)保健，2015，36(14)：139-142.

[11]張如平.樺褐孔菌多糖抗哮喘作用實驗研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012(35)：19.

[12]尹艷，高文宏，于淑娟.多糖提取技術(shù)的研究進展[J].食品工業(yè)科技，2007，(2)：248-250.

[13]趙兵，王玉春，歐陽藩，等.超聲波在植物提取中的應(yīng)用冊中草藥，1999，30(9)：1-3.

[14]趙艷，畢榮宇，牟德華.真菌多糖定量檢測方法研究進展[J].食品與機械，2012，28(6)：264-267.

[15]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T 1676—2008 食用菌中粗多糖含量的測定[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社出版，2008.

[16]李俊，黃錫山.超聲波法提取羅漢果多糖的工藝研究[J].中藥材，2007，30(4)：475-477.