康復新液對光老化HaCaT細胞保護作用的研究

王雄 黃艷麗 錢麗潔

[摘要]目的：觀察康復新液對中波紫外線（UVB）照射損傷后皮膚角質形成細胞（HaCaT細胞）的影響，初步探討其作用機制。方法：采用UVB輻射HaCaT細胞進行造模，分為空白組、模型組、藥物組?？瞻捉M不給予處理，模型組、藥物組分別予不同劑量UVB輻射，藥物組在模型組基礎上給予康復新液。以CCK8法測定細胞增殖活力，酶生化法測定過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、乳酸脫氫酶含量。結果：與模型組比較，同等UVB劑量下藥物組乳酸脫氫酶含量下降（P<0.01），超氧化物歧化酶含量及細胞增殖活力升高（P<0.01）。結論：康復新液可通過減輕UVB對HaCaT細胞氧化應激性損傷，從而達到對HaCaT細胞的保護作用。

[關鍵詞]康復新液；中波紫外線；皮膚角質形成細胞；保護作用；光老化；超氧化物歧化酶

[中圖分類號]R329.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）11-0145-03

Abstract： Objective To observe the protective effect of Kangfuxin Solution on photoaging Human Keratinocytes （HaCaT cells） induced by ultraviolet radiation B （UVB）， and explore its underlying mechanism. Methods The models of photoaging HaCaT cell were established by UVB radiation， which were divided into blank group， model group and drug group， respectively.The blank group was not treated， the model group and the drug group were given different doses of UVB radiation， while the drug group was given the kangfuxinye on the basis of the model group， and then the cell proliferation activity was measured by CCK8. The contents of catalase， superoxide dismutase and lactate dehydrogenase were measured by enzyme biochemical method. Results Compared with the model group of the same UVB dose， the level of lactate dehydrogenase in the drug group was lower（P<0.01）， while the contents of superoxide dismutase， catalase and cell proliferation increased （P<0.01）. Conclusion Kangfuxin Solution has the protective effect on HaCaT cells by inhibiting the damage of UVB to HaCaT cells.

Key words： kangfuxinye； UVB； HaCaT cells； protective effect； light aging； superoxide dismutase

康復新液主要組分為美洲大蠊干燥蟲體的乙醇提取物，有去腐生肌，改善創面微循環，消除炎癥水腫和增強機體免疫等作用[1-2]，其抗氧化作用可提高淋巴細胞及血清溶菌酶的活性，使體內超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）值上升，調節機體的生理平衡[3-4]。但尚未見抗皮膚角質細胞紫外線損傷的相關報道。

本實驗在體外培養永生化人表皮角質形成細胞（HaCaT細胞），以不同劑量中波紫外線（ultraviolet light in medium waves， UVB）照射建立細胞模型，觀察康復新液對UVB損傷光老化HaCaT細胞的影響，初步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：本試驗主要試劑有：康復新液（湖南科倫制藥有限公司，國藥批號Z43020995）；HaCaT細胞（武漢大學中國典型培養物保藏中心）；DMEM培養液（Gibco公司）；胎牛血清（Bovogen公司）；0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）；PBS（Hyclone公司）；CCK8（Cell Counting Kit-8，日本同仁公司）；SOD試劑盒、過氧化物酶（Catalase，CAT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物科技）。主要實驗儀器：UVB光療儀（Sigma公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus）、超凈工作臺、二氧化碳培養箱和酶標儀等（Bio-Rad公司）。

1.2 HaCaT細胞培養：HaCaT細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，置CO2培養箱（培養條件5% CO2、飽和濕度、37℃）中培養。

1.3 UVB誘導細胞老化：參考相關文獻建立細胞光老化模型[5-6]：UVB照射前1d對細胞進行傳代，使其匯合度為50%～70%。照射前將培養液吸去，PBS緩沖液沖洗1次，再加入少量PBS緩沖液覆蓋照射細胞上層，以UVB光源照射。

1.4 分組及干預處理：實驗分為空白、模型組、藥物組?？瞻捉M：HaCaT細胞不給予康復新液，同時也不進行UVB照射；模型組：HaCaT細胞僅進行UVB照射，照射劑量分別為10mJ/cm2、20mJ/cm2、30mJ/cm2；藥物組：細胞經UVB照射處理后再加入康復新液。照射完后，吸棄PBS，加入培養液繼續培養24h，獲細胞培養上清或細胞，用于后續實驗。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖活性：將HaCaT細胞以5×104個/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后，按1.4分組干預方法處理細胞。細胞培養24h后，每孔加入CCK-8溶液10?1，置于37℃，5% CO2培養箱中避光孵育，孵育4h后在酶標儀上于450nm波長處測定各孔的吸光度值。實驗均重復3次，每樣本設3個復孔，結果取平均值。計算細胞存活率公式為：（A藥物組-A空白組）/（A模型組-A空白組）×100%。

1.6 LDH、SOD活性及CAT含量檢測：HaCaT細胞以1×106個/孔接種96孔板，待細胞貼壁后，按1.4分組干預方法處理細胞。細胞培養24h后，收集上清液檢測LDH含量，收集細胞檢測CAT、SOD和CAT含量。實驗重復3次，每樣本設3個復孔。

1.7 統計學方法：采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。實驗數據以（x?±s）表示，組間差異采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同劑量UVB對HaCaT細胞LDH、SOD、CAT及增殖率影響：UVB劑量為0即為空白組，與空白組相比，隨著UVB照射強度增加，模型組HaCaT細胞增殖率逐漸降低（P<0.01），細胞SOD及CAT活性逐漸降低，LDH含量逐漸增加，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

2.2 康復新液對不同劑量光損傷HaCaT細胞的作用：與模型組同等UVB輻射劑量下相關指標比較（見表1），藥物組LDH含量下降（P<0.05），SOD、CAT含量及細胞增殖活力升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

光老化是由于皮膚暴露于UV下而造成的慢性損傷，主要涉及UV誘導活性氧簇產生、蛋白激酶信號通路活化、金屬蛋白酶類表達以及加重炎癥反應等，使表皮異常增生、真皮膠原結構改變、炎癥細胞浸潤，臨床表現為皮膚干燥松弛、皺紋深而多、彈性下降以及色素沉著等[7]，不僅有損皮膚美容，與部分皮膚癌變疾病也有密切關系。目前對皮膚衰老的研究主要是對皮膚成纖維細胞和角質形成細胞衰老的研究。

波長290～320nm的UVB主要作用于表皮，使角質形成細胞產生大量ROS，誘發氧化反應，導致SOD、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶含量下降，其產物丙二醛、LDH含量增加，導致更多ROS的產生，以正反饋形式加劇皮膚組織和細胞的損傷。正常情況下，細胞內存在一系列抗過氧化物酶，可以清除細胞內產生的ROS，當細胞內ROS生成增加、清除能力下降和抗氧化能力減弱時可致細胞氧化損傷[8-9] 。國內外評價皮膚光老化的客觀標準主要是檢測衰老皮膚與正常皮膚中的與氧化相關物質（包括測定SOD、GSH-Px、LDH、CAT、GSH含量和MDA水平）是否存在差異[10-11]。當細胞膜受氧化攻擊受損時，LDH可能通過細胞膜滲出，間接反應細胞氧化應激受損程度。

康復新液是提取美洲大蠊體內的活性物質而成，主要成分為多元醇類及肽類活性物質，含有18種氨基酸，能夠去腐生肌、改善微循環，消除炎癥、水腫和增強機體免疫等作用[4]，還有促進機體的新陳代謝，抗氧化、清除自由基，抗衰老作用[12-13]。

本次實驗對比空白組和模型組發現隨著UVB照射強度增加，HaCaT細胞增殖率逐漸降低，細胞SOD及CAT活性逐漸降低、LDH含量逐漸增加，本次實驗光老化模型建立成功。當實驗加入康復新液后，對比同等UVB劑量下的模型組，發現SOD及CAT活性明顯提高，LDH含量降低，UVB對HaCaT細胞增殖抑制作用減輕，細胞存活率提高。說明康復新液可以對抗UVB對HaCaT細胞膜損傷，保護細胞膜完整性。因此，筆者推測康復新液保護角質形成細胞，促進細胞增殖的作用與其抗氧化、清除自由基有關。

本實驗初步證實康復新液對3種不同劑量UVB照射HaCaT細胞損傷的保護作用，康復新液通過提高細胞中SOD、CAT的活性，降低了LDH漏出量，從而達到抗皮膚光老化的作用，關于不同濃度康復新液對光損傷細胞的保護作用及其具體分子機制，將在后續實驗中做進一步研究。

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[收稿日期]2018-08-15 [修回日期]2018-11-01

編輯/賈敏