電解損毀杏仁中央核對(duì)大鼠牙移動(dòng)疼痛的影響研究

喬虎 黃倩倩 周洪

[摘要]目的：研究杏仁中央核（The central nucleus of amygdala，CeA）對(duì)大鼠牙移動(dòng)疼痛的影響。方法：采用電解損毀方法對(duì)成年雄性大鼠分別行CeA單側(cè)（15只）及雙側(cè)損毀（15只）記為模型組，對(duì)照組行假損毀手術(shù)（30只），術(shù)后恢復(fù)3d，建立實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)模型，記錄牙移動(dòng)痛覺行為學(xué)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后灌流動(dòng)物，取腦組織，切片染色，對(duì)毀損部位進(jìn)行定位。結(jié)果：與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠痛覺行為學(xué)指標(biāo)-面部修整行為（Face-grooming）明顯降低，尤其在加力1d后減少最為顯著，且雙側(cè)損毀CeA對(duì)大鼠痛覺行為學(xué)指標(biāo)的影響，即降低程度大于單側(cè)損毀CeA組。結(jié)論：CeA在大鼠牙移動(dòng)疼痛的調(diào)控中扮演重要角色，損毀CeA可一定程度地改善牙移動(dòng)疼痛癥狀。

[關(guān)鍵詞]杏仁中央核；電解毀損；牙齒移動(dòng)；正畸疼痛；大鼠

[中圖分類號(hào)]R783.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）11-0147-03

Abstract： Objective To study the effect of the central nucleus of amygdala （CeA） lesions on tooth movement induced-pain in rats. Methods Adult male rats were subjected to unilateral or bilateral CeA electrolytic lesions in model group， while the control group underwent false lesion surgery. Three days after surgery， experimental tooth movement model was established to record the changes in behavior of tooth movement induced-pain. Results Compared with the rats in the control group， the rats in the model group showed a significant decrease in the index of pain behavior-face-grooming， especially in one day. Moreover， the effect of bilateral CeA lesions on the rats'pain behavior was significantly reduced， that is， the degree of reduction was greater than that of unilateral CeA lesion group. Conclusion CeA plays an important role in the regulation of tooth movement induced-pain in rats.

Key words： the central nucleus of amygdala； electrolytic lesions； tooth movement； orthodontic pain； rats

在正畸治療過程中，90%～95%患者會(huì)經(jīng)歷因正畸治療而引起牙移動(dòng)疼痛癥狀[1]，此疼痛嚴(yán)重影響患者的矯治積極性，已成為矯治初期患者放棄治療的主要原因之一[2-3]，部分患者甚至因疼痛引發(fā)精神癥狀（抑郁、焦慮等），而無法正常工作、學(xué)習(xí)和生活。故如何減輕牙移動(dòng)疼痛，提高正畸治療品質(zhì)，成為當(dāng)前優(yōu)化正畸治療亟待解決的問題。

以往研究多集中于探討牙移動(dòng)疼痛的外周機(jī)制，而對(duì)其更為復(fù)雜和重要的中樞機(jī)制研究甚少。近年相關(guān)研究表明，杏仁核（amygdala）作為機(jī)體的情緒整合中樞，與疼痛情緒的產(chǎn)生過程及其軀體反應(yīng)（回避行為）均密切相關(guān)[4-5]，被認(rèn)為是聯(lián)系疼痛和情緒的關(guān)鍵核團(tuán)，因此，越來越被學(xué)者所關(guān)注。其中，杏仁中央核（the central nucleus of amygdala，CeA）是杏仁核投射至腦干和下丘腦的主要傳出核團(tuán)，并接受CeA外部的纖維投射，整合多種感覺信號(hào)包括傷害性感覺信息。同時(shí)，CeA也通過與前腦和腦干的廣泛雙向纖維聯(lián)系進(jìn)行疼痛反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

最近，M.Brügger等學(xué)者利用功能性磁共振成像（fMRI）的方法發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電刺激被試者上頜尖牙時(shí)，被試者腦部杏仁核的信號(hào)增強(qiáng)并伴有機(jī)體疼痛不適感[6-7]。Ana Paula等[8]研究證明，實(shí)驗(yàn)性牙齒移動(dòng)促進(jìn)大鼠杏仁中央核及外側(cè)下丘腦區(qū)的Fos蛋白表達(dá)增強(qiáng)，且與施力強(qiáng)度相關(guān)。目前關(guān)于杏仁中央核在正畸疼痛中作用的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，因此為明確CeA在牙移動(dòng)疼痛調(diào)控中的作用，本研究擬對(duì)CeA行小范圍單側(cè)及雙側(cè)電毀損，以探討CeA的功能，為闡明CeA中樞調(diào)控牙移動(dòng)疼痛的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：60只雄性SD大鼠（250±20g，西安交通大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)分為CeA雙側(cè)損毀組（n=15）、CeA單側(cè)損毀組（n=15）和相對(duì)應(yīng)的假損毀對(duì)照組（其中每組n=15）。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF實(shí)驗(yàn)室，固體粉末消毒飼料，飲消毒清水，室溫20℃，定期消毒。

1.2 主要材料和試劑：不銹鋼拉簧（直徑0.25mm、外徑2.0mm、長(zhǎng)度10mm、彈性系數(shù)500N/m，寧波東錢湖康立彈簧五金廠）；正畸測(cè)力計(jì)（807-006型，3M）；正畸用結(jié)扎絲（直徑0.25mm，杭州奧索公司）；慢速牙科電機(jī)，直徑為0.5mm的金剛砂車針（Marathon-6型，韓國(guó)）；京津釉質(zhì)黏結(jié)劑（天津合材廠）；10%水合氯醛；1ml及10ml一次性注射器，75%乙醇，0.9%生理鹽水；眼科剪。

1.3 正畸牙移動(dòng)模型的建立：模型的建立同1.1中的分組方法[9]。用0.25mm結(jié)扎絲將特制的不銹鋼拉簧的一端結(jié)扎于上頜左側(cè)第一磨牙頸部，另一端結(jié)扎于2個(gè)切牙上，并用黏結(jié)劑固定。以50g力拉伸彈簧，使磨牙受到近中方向的拉力，形成大鼠磨牙近中移動(dòng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1.4 雙側(cè)CeA電解損毀術(shù)：腹膜腔內(nèi)注射水合氯醛溶液（10% W/V，300 mg/kg），麻醉大鼠后，將其固定于腦立體定位儀上（SN-2N，Narishige，Tokyo，Japan），使前、后囟門處于同一水平面，顱骨左右對(duì)稱。酒精消毒，去除顱頂毛發(fā)及皮膚，暴露顱骨，根據(jù)大鼠腦圖譜確定CeA的位置（前囟后2.5mm，中線旁開4.2mm，顱骨表面下7.5mm）。用微型電鉆在CeA描點(diǎn)處開孔至暴露硬腦膜，去除碎骨片及硬腦膜，植入同心圓損毀電極（CEA 200，Microprobes， USA），電極正、負(fù)極分別與直流電損毀儀（53500，Ugo Basile，Italy）輸出端對(duì)應(yīng)相接。地線接頭夾于大鼠后肢上。開始實(shí)施電損毀刺激，即直流電刺激，400?A，持續(xù)25s，對(duì)照組操作時(shí)斷開刺激輸出，其余操作步驟相同。大鼠CeA電損毀后恢復(fù)3～5d，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 尼氏染色：選取CeA腦區(qū)的冠狀切片，水化后切片浸入0.1%焦油紫染液中染色，時(shí)間為30min，分色，通過鏡下觀察控制染色時(shí)間，以觀察到清晰的尼氏小體為準(zhǔn)。蒸餾水沖洗后分別在85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中依次進(jìn)行脫色，時(shí)間為1min，二甲苯透明2次，每次時(shí)間為5min。最后滴加適量中性樹膠，覆蓋蓋玻片，進(jìn)行封片。鏡下觀察各組CeA電損毀具體部位及范圍。

1.6 面部修整行為（Face-grooming）活動(dòng)：包括多種動(dòng)作，比如洗臉、搖頭、舔爪、按摩下巴和擦拭口等。其中，擦拭口動(dòng)作是最為突出的行為反應(yīng)，可作為一種重復(fù)性強(qiáng)且可靠的測(cè)量實(shí)驗(yàn)性牙齒移動(dòng)所引發(fā)疼痛的手段。測(cè)試具體方法為：在背景噪音不高于45db的房間中，將小鼠放置在一個(gè)透明的塑料籠（30cm×30cm×30cm）內(nèi)。每天上午9：00～12：00使用攝像機(jī)監(jiān)測(cè)小鼠face-rubbing活動(dòng)。在記錄開始前小鼠提前15min適應(yīng)房間環(huán)境，每次監(jiān)測(cè)時(shí)間為10min，每只小鼠記錄3次，中間間隔20min。記錄后的數(shù)據(jù)采用盲法分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)一以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，統(tǒng)計(jì)方法選用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析，對(duì)時(shí)間和處理的主效應(yīng)及其交互效應(yīng)進(jìn)行分析，進(jìn)一步多重比較采用LSD檢驗(yàn)方法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)定位：雙側(cè)CeA損毀部位位于視束尖端的背外側(cè)；杏仁基底外側(cè)核的背內(nèi)側(cè)及杏仁基底內(nèi)側(cè)核和杏仁內(nèi)側(cè)核的背側(cè)。85%以上的吻尾向CeA被電解損毀所破壞。測(cè)試的60只動(dòng)物中，共38只大鼠損毀位置準(zhǔn)確，其中雙側(cè)準(zhǔn)確損毀組9只，單側(cè)準(zhǔn)確損毀組10只，雙側(cè)假損毀組位置準(zhǔn)確9只，單側(cè)假損毀組位置正確10只。其他動(dòng)物損毀位置或電極放置位置在CeA之外，這些結(jié)果均不納入統(tǒng)計(jì)分析。典型CeA雙側(cè)電解損毀示意圖，見圖1。

2.2 雙側(cè)CeA損毀對(duì)大鼠牙移動(dòng)疼痛行為學(xué)的影響：各組大鼠牙齒加力后均出現(xiàn)face-grooming等典型的痛覺行為學(xué)改變，即實(shí)驗(yàn)組牙齒加力后4h、8h、1d、3d、5d、7d、14d，大鼠的面部修整行為時(shí)間顯著增多（1d時(shí)為高峰，隨后逐漸減少），14d后與對(duì)照組比較無顯著差異。

與對(duì)照組相比，雙側(cè)損毀CeA組大鼠的牙移動(dòng)痛覺行為學(xué)減弱[F（1，8）=5.63，P<0.05]，尤其在4h～5d時(shí)間段內(nèi)最為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05， LSD檢驗(yàn)）；而在7d和14d時(shí)間點(diǎn)上，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05， LSD檢驗(yàn)）。見圖2。

2.3 單側(cè)CeA損毀對(duì)大鼠牙移動(dòng)疼痛行為學(xué)的影響：與對(duì)照組相比，單側(cè)損毀CeA組大鼠的牙移動(dòng)痛覺行為學(xué)也有明顯的減弱[F（1，9）=6.71，P<0.05]，其變化規(guī)律與雙側(cè)損毀CeA組近似，尤其在8h～3d時(shí)間段內(nèi)最為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，LSD檢驗(yàn)）；而在其余時(shí)間點(diǎn)上，與對(duì)照組相比，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，LSD檢驗(yàn)）。由此可見，與雙側(cè)損毀CeA組相比，單側(cè)損毀CeA組大鼠的牙移動(dòng)痛覺行為學(xué)的減弱程度要更弱，見圖3。

3 討論

疼痛是一種不愉快的感覺和情緒體驗(yàn)，伴隨有強(qiáng)烈的負(fù)性情緒和對(duì)疼痛刺激的回避行為。目前認(rèn)為正畸疼痛的產(chǎn)生是由矯治力刺激牙周、牙髓組織傷害感受器引起興奮產(chǎn)生沖動(dòng)，并伴隨局部炎癥介質(zhì)釋放[10-12]，沖動(dòng)經(jīng)過Aδ纖維和C纖維傳遞至三叉神經(jīng)節(jié)，最后向中樞神經(jīng)系統(tǒng)投射而被感知。

近年已有研究表明，杏仁核（amygdala）作為機(jī)體的情緒整合中樞，與疼痛情緒的產(chǎn)生過程及其軀體反應(yīng)（回避行為）均密切相關(guān)[4-5]，被認(rèn)為是聯(lián)系疼痛和情緒的關(guān)鍵核團(tuán)，越來越被學(xué)者所關(guān)注。杏仁核作為邊緣前腦的重要結(jié)構(gòu)，包含十多個(gè)大小不同的核團(tuán)，功能復(fù)雜[13]。其中，杏仁中央核（The central nucleus of amygdala， CeA）是杏仁核投射至腦干和下丘腦的主要傳出核團(tuán)，并接受CeA外部的纖維投射，其大量的外部投射終止于囊區(qū)（capsular CeA，CeC）和外側(cè)區(qū)（lateral CeA，CeL），兩者之間也存在交互纖維聯(lián)系。CeA主要接受脊髓（三叉神經(jīng)）-臂旁核-杏仁中央核通路的投射，整合多種感覺信號(hào)包括傷害性感覺信息。同時(shí)，CeA也通過與前腦和腦干（包括額葉皮層、海馬、前扣帶回、外側(cè)下丘腦、臂旁核，孤束核及參與內(nèi)源性疼痛調(diào)節(jié)的腦干核團(tuán)）的廣泛雙向纖維聯(lián)系進(jìn)行疼痛反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

杏仁核中有特異性和非特異性傷害感受神經(jīng)元可以接受傷害性刺激的傳入，并和其他形式的感覺刺激信息進(jìn)行整合，在下意識(shí)水平中形成對(duì)傷害性刺激的情緒反應(yīng)和逃避動(dòng)機(jī)，并進(jìn)而通過其與皮層的雙向聯(lián)系形成意識(shí)水平的情感，通過與下丘腦及腦干多個(gè)核團(tuán)之間的投射，產(chǎn)生內(nèi)臟的情緒反應(yīng)，通過與扣帶運(yùn)動(dòng)區(qū)的纖維聯(lián)系將傷害性刺激的逃避動(dòng)機(jī)轉(zhuǎn)化為軀體行為。杏仁核與內(nèi)源性痛覺調(diào)制通路中的很多部位有纖維聯(lián)系，可以通過這些部位參與內(nèi)源性鎮(zhèn)痛及應(yīng)激鎮(zhèn)痛等。杏仁核與疼痛和鎮(zhèn)痛均有緊密相關(guān)。

影像學(xué)、藥理學(xué)及生理學(xué)等多種學(xué)科均證實(shí)杏仁核參與了疼痛的調(diào)控。Helmstette等發(fā)現(xiàn)杏仁核在應(yīng)激鎮(zhèn)痛時(shí)主要是通過激活腦干的下行抗傷害系統(tǒng)發(fā)揮作用的，損傷杏仁核可減弱應(yīng)激的鎮(zhèn)痛作用。利用功能磁共振成像（fMRI）的方法發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予伴有能夠引起強(qiáng)烈情緒反應(yīng)的疼痛刺激時(shí)，杏仁核的信號(hào)增強(qiáng)。由于在fMRI實(shí)驗(yàn)中，杏仁核在疼痛時(shí)的激活為雙側(cè)性，因此Bingel等[14]認(rèn)為杏仁核負(fù)責(zé)處理與疼痛情感成分有關(guān)的信息，但也有實(shí)驗(yàn)表明在給予傷害性熱刺激時(shí)杏仁核信號(hào)降低[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與假損毀對(duì)照組相比，雙側(cè)損毀CeA組大鼠的牙移動(dòng)痛覺行為學(xué)減弱，尤其在4h～5d時(shí)間段內(nèi)最為明顯，而在7d和14d時(shí)間點(diǎn)上，與對(duì)照組無明顯差異。單側(cè)損毀CeA組大鼠的牙移動(dòng)痛覺行為學(xué)也有明顯的減弱，其變化規(guī)律與雙側(cè)損毀CeA組近似，但減弱程度比雙側(cè)損毀要更弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在其余時(shí)間點(diǎn)上，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以上結(jié)果表明損毀杏仁中央核可顯著減弱大鼠牙移動(dòng)疼痛的程度，主要原因可能為為杏仁中央核參與了牙移動(dòng)疼痛的中樞調(diào)控，如痛覺的編碼和調(diào)制過程，故將該核團(tuán)損毀后可起到阻斷痛覺傳導(dǎo)的效果，因此大鼠的牙移動(dòng)疼痛癥狀可獲得改善。

綜上所述，杏仁中央核在牙移動(dòng)疼痛調(diào)控中扮演重要角色，起著正性調(diào)控作用，有助于更深入理解正畸疼痛反應(yīng)的機(jī)制，并將為正畸疼痛的治療提供新的方法。

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[收稿日期]2018-07-15 [修回日期]2018-10-31

編輯/賈敏