皮膚橋蛋白在肥胖小鼠脂肪中的表達

白寧寧，嚴寒，琚麗萍，陳淑芹，張菁，胡瑞瑋，楊穎，方啟晨

（上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院糖尿病研究所，上海200233）

脂肪組織的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是存在于細胞之間的致密動態(tài)網絡結構，主要由血管基質細胞（stromal vascular fraction，SVF）和脂肪細胞合成和分泌，不僅為脂肪組織提供結構支撐，還可通過各種細胞外信號途徑，在生理和病理條件下調節(jié)脂肪組織重構[1]。ECM由多種成分組成，其中很大比例是各種類型的膠原蛋白，比如Ⅰ－Ⅳ型膠原蛋白[2]。此外，還存在許多非膠原蛋白，動態(tài)調節(jié)組織結構與功能。

皮膚橋蛋白（dermatopontin，DPT）是一種相對分子質量為22 kD的分泌性蛋白，最初在提純牛皮膚核心蛋白多糖的實驗中被發(fā)現[3]。DPT在ECM非膠原蛋白中所占比例非常高，在哺乳動物皮膚、骨骼肌、心臟、肺、肝等組織和器官中廣泛表達[4]，其部分酪氨酸殘基可被硫酸化，硫酸化的酪氨酸可以調節(jié)ECM蛋白間的相互作用[5]。我們在實驗中發(fā)現DPT在人和小鼠脂肪中的基礎表達很高，但目前尚不明確DPT作為一種非膠原蛋白在脂肪組織中的作用。另外，抗糖尿病藥物過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）激動劑可通過抑制脂肪細胞和巨噬細胞中膠原蛋白的轉錄，從而發(fā)揮潛在的抗纖維化作用[6]，但它對非膠原蛋白DPT基因表達的影響報道甚少。本研究擬在飲食誘導肥胖小鼠模型上觀察DPT在脂肪組織中的表達變化，以及PPARγ激動劑羅格列酮干預后3T3-L1分化成熟的脂肪細胞DPT基因的變化趨勢，為進一步探討DPT在肥胖等代謝性疾病中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

35只6周齡雄性C57BL/6J小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），普通飼料和高脂飼料（Diet Research公司），3T3-L1細胞株（ATCC細胞庫），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司），羅格列酮、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、膠原酶（Sigma公司），胰島素（常規(guī)優(yōu)泌林），Trizol試劑（Invitrogen公司），RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF和BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天公司），引物（上海生物工程有限公司），逆轉錄和SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa公司），鼠源性DPT單克隆抗體（Santa公司），兔源性HSP90多克隆抗體作為內參抗體（Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 飲食誘導肥胖小鼠模型的建立 6周齡C57BL/6J雄性小鼠適應性喂養(yǎng)2周后，隨機分為正常飲食組和高脂飲食組，分別給予普通飼料 （10%熱卡來自脂肪）和高脂飼料（60%熱卡來自脂肪）喂養(yǎng)16周，每組各10只。以上實驗經過上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院動物福利與倫理委員會的批準。

1.2.2 脂肪組織SVF和脂肪細胞的分離 15只6周齡小鼠分為3組，每組5只。小鼠過量麻醉處死后，取出皮下和內臟脂肪，緩沖液反復沖洗后剪碎，膠原酶 37℃消化 60 min，2 000 r/min離心 10 min。去上清液，紅細胞裂解液處理10 min，離心去上清液；緩沖液沖洗離心，靜置10 min，上層為脂肪細胞，下層為SVF。

1.2.3 3T3-L1細胞的誘導分化及藥物處理 將3T3-L1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，待細胞融合后，加入誘導液A（10%胎牛血清的 DMEM含 0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松、1.7μmol/L胰島素），隔天更換誘導液B（10%胎牛血清的DMEM含1.7μmol/L胰島素），繼續(xù)培養(yǎng)直至出現大量脂滴。濃度梯度實驗：以不同劑量（0、0.25、0.5、1、2μmol/L）羅格列酮處理脂肪細胞24 h；時間梯度實驗：以2μmol/L羅格列酮處理脂肪細胞 0、4、12、24、48 h。

1.2.4 實時定量PCR測定DPTmRNA表達 小鼠組織和細胞采用Trizol試劑抽提RNA，經逆轉錄成為cDNA，并由qPCR試劑盒進行擴增。引物序列如下，DPT：正義 5′-CTGCCGCTATAGCAAGAGGT-3′，反義 5′-TGGCTTGGGTACTCTGTTGTC-3′；36B4：正義 5′-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCT-3′，反 義 5′-CCGCAGGGGCAGCAGTGGT-3′。以 36B4作為內參，計算DPTmRNA的相對拷貝數2－△△Ct。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測DPT蛋白的表達 小鼠組織和細胞總蛋白采用RIPA裂解液提取，經BCA蛋白定量試劑盒測總蛋白濃度，最后加熱變性。取20～60μg蛋白樣本聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉蛋白至硝酸纖維素膜，孵育一抗4℃過夜。次日TBST洗3次，每次5 min，過氧化物酶標記的抗兔（鼠）二抗室溫孵育1 h，再次TBST洗3次，每次5 min。最后經ImageQuant凝膠圖像分析儀曝光成像。

1.2.6 GEO數據庫芯片分析 登錄NCBI數據庫Gene Expression Omnibus（GEO）Profiles窗口 （http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“DPT，adipose tissue”為檢索詞，獲得芯片及探針數據GDS3142/1418511＿at。GDS3142代表小鼠各組織基因表達芯片這一數據集，而1218511＿at代表DPT這一基因的探針，數據涉及22個器官或組織。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 DPT在人和小鼠的脂肪組織中高度表達

圖1 DPT在人類主要組織的表達譜

首先利用人類蛋白質門戶（The Human Protein Atlas）數據庫和2015年發(fā)表在《Science》上的一項人類蛋白質圖譜研究[7]，發(fā)現DPT基因在人類大多數組織中均有表達，其中mRNA表達水平在脂肪中表達最高（圖1）。同時利用 GEO數據庫（GDS3142/1418511＿at）發(fā)現，DPT mRNA在小鼠各組織的表達與人類類似，同樣在脂肪中表達最高（圖2）。提取6周齡小鼠主要組織（包括皮下、內臟、棕色脂肪，腓腸肌和比目魚肌）的RNA和蛋白，對DPT在各組織的表達進行驗證。實時定量PCR和蛋白質印跡結果顯示，DPTmRNA和蛋白表達水平均在白色脂肪中最高，其次是棕色脂肪，但在腓腸肌和比目魚肌中的表達較低（圖3）。

圖2 DPT在小鼠主要組織的表達譜

圖3 DPT mRA和蛋白在小鼠主要組織的表達

2.2 高脂飲食明顯增加白色脂肪中DPT表達水平

提取正常飲食組和高脂飲食組小鼠皮下、內臟、棕色脂肪和腓腸肌、比目魚肌的RNA和蛋白。實時定量PCR結果表明，與正常飲食組相比，高脂飲食組小鼠的皮下、內臟、棕色脂肪中DPTmRNA表達水平均明顯增加，其中在皮下脂肪中升高約6倍（t＝－8.264，P＜0.01），在內臟脂肪中升高約 2倍（t＝－4.964，P＜0.01），在棕色脂肪中升高 1.5倍左右（t＝－2.789，P＜0.01）。但腓腸肌和比目魚肌中DPTmRNA表達水平兩組間差異無統(tǒng)計學意義（圖4A）。蛋白質印跡結果表明，與正常飲食組相比，DPT蛋白表達水平在高脂飲食組小鼠白色脂肪中增加，其中皮下脂肪增加較為明顯（圖4B）。

圖4 DPT在正常和肥胖小鼠主要組織中的表達

2.3 DPT主要由脂肪細胞合成并分泌至胞外

進一步分離6周齡小鼠皮下和內臟脂肪組織的SVF和脂肪細胞，發(fā)現脂肪細胞的DPTmRNA和蛋白表達水平明顯高于在SVF中的表達（圖5）。

圖5 6周齡小鼠皮下和內臟脂肪組織SVF和脂肪細胞中DPT mRNA和蛋白表達差異

同時，在3T3-L1前脂肪細胞誘導分化為脂肪細胞的過程中，DPTmRNA表達水平從分化第4天起逐漸增加，并在第8天達到最高；同樣在其分化過程的細胞裂解物和上清液中，DPT蛋白表達水平也逐漸增加，并于第8天達到最高（圖6）。

圖6 DPT在3T3-L1細胞分化過程中的表達

2.4 羅格列酮下調3T3-L1脂肪細胞中DPT表達水平

實時定量PCR結果顯示，與對照組相比，以0.25、0.5、1、2μmol/L羅格列酮處理脂肪細胞 24 h后，DPTmRNA表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；以 2μmol/L羅格列酮處理脂肪細胞 4、12、24、48 h，DPTmRNA表達水平在4 h、12 h無明顯變化，但隨著處理時間的延長，在24 h、48 h降低明顯（P＜0.05或P＜0.01）。以2μmol/L羅格列酮處理脂肪細胞48 h、72 h，DPT蛋白表達水平均明顯降低（圖7）。

3 討論

脂肪組織快速擴張的能力主要依賴于組織內各種細胞的協同反應，共同參與重構過程中的ECM重構、急性炎癥反應及適度的血管新生，其中ECM重構發(fā)揮關鍵作用[8]。而肥胖狀態(tài)下，脂肪組織發(fā)生纖維化、慢性炎癥反應及血管新生受損等病理性改變，是肥胖癥及糖尿病等系統(tǒng)性代謝紊亂的主要致病因素[9]。既往研究顯示，高脂飲食誘導的肥胖小鼠的脂肪組織中存在包括Ⅳ型膠原在內的膠原沉積[6]。而膠原蛋白沉積使脂肪組織可塑性減弱，并且促進肥胖機體代謝紊亂，許多其他非膠原ECM成分在肥胖機體脂肪組織也處于失調狀態(tài)[10－11]。

DPT作為一種非膠原ECM蛋白，可以與核心糖蛋白、TGF-β、Ⅰ型膠原蛋白等作用，并具有促進膠原纖維形成等功能，在多種與ECM有關的生理和病理過程中發(fā)揮作用[12－13]。最近的一項研究發(fā)現，在超重/肥胖合并非乙醇性肝炎和肝臟纖維化患者的肝臟中DPT的表達增加，而通過代謝手術治療肥胖的同時，患者肝纖維化明顯緩解，且肝臟中DPT的表達降低[14]；通過 DPT－/－小鼠模型觀察到 DPT對膠原蛋白沉積和纖維化有促進作用，而過氧化物酶體增殖物激活受體-α激活后可有效降低DPT的表達。這項研究充分說明DPT與組織纖維化之間的密切聯系，DPT可能成為逆轉組織纖維化進程的一個有效作用靶點。另外一項研究發(fā)現DPT可以調節(jié)內皮細胞TGF-β1和整合素α3β1的表達，從而促進血管新生過程[15]。

圖7 羅格列酮對3T3-L1脂肪細胞DPT基因表達的調控

本研究發(fā)現細胞外基質成員DPT在人和小鼠脂肪中表達很高，小鼠高脂飲食后DPT在脂肪中的表達明顯增加，特別是白色脂肪。我們進一步發(fā)現DPT主要由脂肪細胞合成并分泌。這提示脂肪組織作為一個活躍的內分泌器官，應對營養(yǎng)變化時，脂肪細胞本身可以分泌多種因子從而調節(jié)機體代謝。高脂飲食后脂肪細胞分泌增加的DPT廣泛分布于細胞外，從而影響肥胖發(fā)生發(fā)展進程中伴隨的脂肪組織結構及功能。但是DPT具體通過何種機制影響脂肪組織的結構和功能，以及DPT的表達水平是否與肥胖機體脂肪組織纖維化相關，尚需進一步明確。另外本研究發(fā)現，羅格列酮處理3T3-L1脂肪細胞后，DPT的表達量明顯降低。這說明PPARγ激動劑作為一種抗糖尿病藥物，不僅可以有效降低脂肪細胞中膠原蛋白的轉錄，從而抵抗纖維化的發(fā)生，同時可調控非膠原蛋白DPT的表達。如果DPT是肥胖發(fā)展過程中脂肪組織纖維化的風險因子之一，那么通過藥物干預DPT的表達，有可能改善肥胖相關的脂肪組織結構及功能紊亂。

[1]Sun K，Kusminski CM，Scherer PE.Adipose tissue remodeling and obesity[J].J Clin Invest，2011，121（6）：2094－2101.

[2]Ricard-Blum S，Ruggiero F.The collagen superfamily：from the extracellular matrix to the cellmembrane[J].Pathol Biol（Paris），2005，53（7）：430－442.

[3]Neame PJ，Choi HU，Rosenberg LC.The isolation and primary structure of a 22-kDa extracellularmatrix protein from bovine skin[J].J Biol Chem，1989，264（10）：5474－5479.

[4]Okamoto O，Fujiwara S.Dermatopontin，a novel player in the biology of the extracellular matrix[J].Connect Tissue Res，2006，47（4）：177－189.

[5]Yamatoji M，Kasamatsu A，Kouzu Y，et al.Dermatopontin：a potential predictor formetastasis of human oral cancer[J].Int J Cancer，2012，130（12）：2903－2911.

[6]Khan T，Muise ES，Iyengar P，et al.Metabolic dysregulation and adipose tissue fibrosis：role of collagen VI[J].Mol Cell Biol，2009，29（6）：1575－1591.

[7]Uhlen M，Fagerberg L，Hallstrom BM，et al.Proteomics.Tissue-based map of the human proteome[J].Science，2015，347（6220）：1260419.

[8]Mariman EC，Wang P.Adipocyte extracellular matrix composition，dynamics and role in obesity[J].CellMol Life Sci，2010，67（8）：1277－1292.

[9]Crewe C，An YA，Scherer PE.The ominous triad of adipose tissue dysfunction：inflammation，fibrosis，and impaired angiogenesis[J].JClin Invest，2017，127（1）：74－82.

[10]Lin D，Chun TH，Kang L.Adipose extracellular matrix remodelling in obesity and insulin resistance[J].Biochem Pharmacol，2016，119：8－16.

[11]Spencer M，Unal R，Zhu B，etal.Adipose tissue extracellularmatrix and vascular abnormalities in obesity and insulin resistance[J].JClin Endocrinol Metab，2011，96（12）：E1990－1998.

[12]MacBeath JR，Shackleton DR，Hulmes DJ.Tyrosine-rich acidic matrix protein（TRAMP）accelerates collagen fibril formation in vitro[J].J Biol Chem，1993，268（26）：19826－19832.

[13]Kato A，Okamoto O，Ishikawa K，et al.Dermatopontin interacts with fibronectin，promotes fibronectin fibril formation，and enhances cell adhesion[J].J Biol Chem，2011，286（17）：14861－14869.

[14]Lefebvre P，Lalloyer F，Bauge E，et al.Interspecies NASH disease activity whole-genome profiling identifies a fibrogenic role of PPARα-regulated dermatopontin[J].JCI Insight，2017，2（13）：e92264.

[15]Krishnaswamy VR，Balaguru UM，Chatterjee S，et al.Dermatopontin augments angiogenesis and modulates the expression of transforming growth factorβ1 and integrin α3β1 in endothelial cells[J].Eur JCell Biol，2017，96（3）：266－275.