LSD1對非小細胞肺癌細胞增殖與遷移的影響

洪娟，王冬青，殷瑞根，趙天，朱彥

（江蘇大學附屬醫院影像科，江蘇鎮江212001）

賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1，LSD1）是一種高度保守的 FAD依賴性胺氧化酶，可通過氧化去除底物甲基化的H3K4、H3K9的甲基，也可去除組蛋白以外結構上的甲基，從而影響基因表達[1－2]。諸多研究證實，LSD1過表達與多種腫瘤如乳腺癌、前列腺癌等發展、侵襲及預后不良相關[3－8]。此外，據報道，LSD1的小分子抑制劑在血液系統腫瘤及實體腫瘤的治療中顯示出良好的治療前景[9－10]，抑制 LSD1表達后可阻止上皮間質轉化（EMT）的進程從而延緩前列腺癌的進展[11]。本研究通過比較LSD1在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織和細胞中的表達，分析其與臨床病理特征的關系；探討外源性干擾LSD1表達后，細胞一系列生物學功能的改變及調節機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例 收集2010年3月至2013年3月于江蘇大學附屬醫院胸外科行部分肺葉切除的52例NSCLC患者肺癌組織及癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5 cm）。其中，男31例，女21例。年齡41～78歲，所有患者術前均未行放療、化療，所有標本均經過病理證實。其中，鱗癌25例，腺癌27例。

1.1.2 試劑及儀器 NSCLC細胞株A549及人支氣管上皮細胞株16HBE購自中國科學院上海細胞所；RPMI 1640、DMEM、胎牛血清（美國 Gibco公司）；RNA抽提劑 Trizol、LSD1小干擾 RNA（si-LSD1）、陰性對照、轉染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；Transwell小室（美國Millipore公司）；MTT（美國Cell Signaling Technology公司）；qRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；E-鈣黏蛋白、波形蛋白及對照GAPDH抗體均為美國Santa Cruz公司產品。

1.2 方法

1.2.1 A549肺癌細胞培養、分組與轉染 在37℃、相對濕度及5%CO2條件下，將A549肺癌細胞置于含10%胎牛血清的1640培養液中培養。同時，用含10%胎牛血清的DMEM培養肺正常上皮16HBE細胞。取對數生長期A549肺癌細胞，并于轉染前24 h接種至6孔板（3×105個/孔），繼續培養，待細胞生長融合度達70%～80%時進行轉染。轉染依照說明書，將10μL si-LSD1轉染入A549細胞中（si-LSD1組），另轉染陰性對照作為對照組，在37℃及5%CO2培養箱中繼續培養，用于后續相關實驗檢測。

1.2.2 qRT-PCR檢測 LSD1和 EMT相關蛋白的mRNA表達 用Trizol提取組織和細胞總RNA，行反轉錄獲得cDNA，然后對產物進行擴增。GAPDH引物序列，上游：5′-GCAAATTCCATGGCACGTC-3′，下游：5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′；LSD1引物序列，上 游：5′-CAAGTGTCAATTTGTTCGGG-3′，下游：5′-TTCTTTGGGCTGAGGTACTG-3′；E-鈣黏蛋白引物序列，上游：5′-AAACCTTGCCTTCTTTGTC-3′，下游：5′-TTCCCAACTCCTCTCCTG-3′，波形蛋白引物序列，上游：5′-CGGTTCGCCAACTACAT-3′，下游：5′-AGGGC-ATCCACTTCACAG-3′。PCR反應條件：90℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。以 GAPDH作為內參，采用2－ΔΔCt法計算LSD1相對表達量。

根據NSCLC組織中LSD1相對表達量的中位數，將NSCLC患者分為LSD1低表達組（≤中位數）和高表達組（＞中位數）。

1.2.3 MTT比色法實驗 取“1.2.1”轉染后細胞，接種于96孔板，每孔2×103個，每組6個復孔，獲得單細胞懸液，37℃及5%CO2飽和濕度培養24～96 h；每孔加入5 mg/mL MTT 20μL，孵育4 h；棄培養基，加入DMSO 150μL/孔，振蕩10min；待結晶物充分溶解，于酶標儀490 nm處檢測各孔光密度（D）值。

1.2.4 細胞集落形成實驗 取“1.2.1”轉染后細胞，接種于6孔板，每孔1×103個，吹打至均勻，繼續培養；4 d后更換培養基，繼續培養；直至10 d后培養基內肉眼可見克隆終止培養；4%甲醇固定約15 min；結晶紫染色10 min；洗凈并晾干。

1.2.5 細胞凋亡檢測 取“1.2.1”轉染后細胞，收集3×105個，加入100μL結合緩沖液，使細胞懸??；順序加入5μL Annexin V及5μL PI，混勻，于室溫避光孵育15 min；加入400μL結合緩沖液，運用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 Transwell遷移實驗 取“1.2.1”轉染后細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL，分別將300μL細胞懸液和700μL含10%胎牛血清的RPMI 1640加入每個Transwell上室和下室，并于37℃，5%CO2條件下培養48 h；取出Transwell小室，吸棄液體，醫用棉簽擦凈內部基底膜；PBS漂洗，4%低聚甲醛固定10 min；結晶紫染液染色20 min；清水漂洗，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達 用全蛋白裂解液提取待測細胞總蛋白；上樣30μg，行 SDS-PAGE；轉至 PVDF膜，TBST（含5%脫脂牛奶）封閉2 h；1×TBST洗膜4次，每次5 min；一抗波形蛋白（1∶200）、E-鈣黏蛋白（1∶250）、GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過夜；洗膜，加入相應二抗（1∶3 000），室溫孵育2 h；1×TBST洗膜3次；暗室ECL發光顯色并行曝光拍照。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0分析數據，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，所有實驗均重復3次。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LSD1在NSCLC癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

qRT-PCR檢測結果如圖1所示，與癌旁組織相比，NSCLC組織中 LSD1表達明顯增高（t＝2.861，P＜0.05）。由表1可見，LSD1表達量與NSCLC患者 TNM分期及淋巴結轉移相關（χ2＝4.062，6.047，P＜0.05），中晚期及轉移患者LSD1呈高表達，而患者年齡、性別、吸煙、腫瘤直徑、病理分型與LSD1水平未見明顯關系。

圖1 NSCLC組織和癌旁組織中LSD1 mRNA表達比較

表1 LSD1 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 例（%）

2.2 LSD1在肺癌細胞中的表達量以及si-LSD1的干擾效率

如圖2所示，LSD1在A549細胞中表達量明顯高于16HBE細胞（t＝3.569，P＜0.05）。為驗證 si-LSD1的干擾效率，在轉染48 h后，qRT-PCR檢測顯示，si-LSD1組A549細胞LSD1表達量較對照組明顯下降（t＝4.825，P＜0.05），干擾效率達 80%以上，可用于后續實驗。

圖2 qRT-PCR檢測細胞中LSD1 mRNA的表達

2.3 LSD1對A549細胞增殖能力的影響

如圖3所示，MTT實驗結果顯示，與對照組相比，在48、72、96 h時si-LSD1轉染組細胞增殖能力均較對照組低（P＜0.05），表明si-LSD1轉染組細胞增長速度受到抑制；克隆形成實驗顯示轉染si-LSD1組細胞克隆形成能力降低。由此可見，干擾A549細胞中LSD1表達后，細胞增殖能力下降。

2.4 LSD1對A549細胞凋亡的影響

流式細胞檢測分析顯示，與對照組相比，轉染si-LSD1組細胞凋亡率明顯增加（t＝3.618，P＜0.05）。由此表明，抑制LSD1表達可促進A549細胞凋亡。見圖4。

圖3 各組細胞增殖力比較

圖4 各組細胞凋亡率比較

2.5 LSD1對細胞遷移能力的影響

Transwell實驗檢測結果顯示，與對照組相比，si-LSD1轉染組細胞穿透基膜的能力明顯降低。由此說明，干擾LSD1表達后能夠明顯抑制A549細胞的遷移能力。見圖5。

圖5 Transwell實驗檢測細胞的遷移能力

2.6 LSD1對EMT相關分子的調控作用

qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，轉染 si-LSD1組上皮標志分子E-鈣黏蛋白mRNA水平上調，間質標志分子波形蛋白mRNA表達下調；蛋白質印跡法結果顯示，與對照組相比，轉染si-LSD1組E-鈣黏蛋白表達水平增加（t＝5.607，P＜0.05），波形蛋白表達降低（t＝－6.628，P＜0.05）。見圖6。綜上，LSD1可能通過調控EMT相關分子的表達，參與A549細胞增殖與遷移的調控。

圖6 EMT相關分子mRNA和蛋白的表達

3 討論

LSD1是胺氧化酶家族的重要成員，亦稱KIAA0601、AOF2、KDM1，在腫瘤發生、發展、侵襲、轉移中的作用已得到諸多研究者的認同[3－5]，如LSD1與腫瘤抑制基因p53相互作用，與脫乙?；笍秃衔铮∟uRD）形成LSD1/NuRD影響腫瘤的進展及侵襲的關鍵信號通路TGF-β，調節人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）等[6－8]。近來研究發現，LSD1介導的EMT可能通過調控轉錄因子表達及miRNA轉錄后修飾影響腫瘤的侵襲與轉移能力[12]。另有文獻證實，LSD1高表達與表皮生長因子（EGF）信號過度激活有關，活化的EGF信號通路能夠促進LSD1表達；反之，抑制LSD1表達，可阻斷EGF誘導的卵巢癌細胞增殖與遷移[13]。無疑，LSD1可能是轉移性腫瘤的一個潛在治療靶點，并提示其在腫瘤增殖與遷移中的研究價值。關于腫瘤微環境與代謝的研究進一步證實LSD1可抑制細胞線粒體呼吸、促進糖酵解途徑，從而加速食管癌細胞的代謝，增強食管癌細胞的轉移和侵襲能力，并加強其惡性生物學行為[14]。

本研究顯示在中晚期及轉移性NSCLC患者癌組織中LSD1表達增加，且與腫瘤分期及淋巴轉移相關，不僅闡明LSD1與NSCLC的惡性表型相關，也提示LSD1可能參與NSCLC細胞的增殖與轉移能力的調控。朱繼云等[12]報道LSD1通過組蛋白修飾實現對前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌增殖和遷移的影響。本研究進一步體外實驗結果顯示，干擾LSD1可顯著抑制細胞的增殖和遷移能力，并增加細胞凋亡率，從機制學層面證實LSD1對NSCLC增殖和遷移的影響?，F有文獻已證實LSD1可通過調節 TGF-β1激活 ERK、NF-κB通路；調控關鍵蛋白Wnt3a的胞外分泌量來影響Wnt經典通路；另外，LSD1可通過上調EMT的標志蛋白E-鈣黏蛋白的表達來激活其啟動子[15]。腫瘤細胞增殖和遷移受多種信號通路調控，如Wnt、NF-κB等經典信號通路。本研究未對LSD1對信號通路中蛋白因子的作用行具體分析，其在腫瘤尤其在NSCLC中的作用和機制有待進一步研究。

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