肺腺癌轉移相關轉錄本1在乳腺癌患者血漿中的表達及臨床意義

楊卉，許文林，蘇兆亮，陳琦

（1.江蘇大學第四附屬醫(yī)院乳腺科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

乳腺癌是女性最為常見的一種惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率呈不斷上升的趨勢[1－2]，早期診斷和治療可有效降低死亡率。目前，乳腺癌的疾病篩查和對重點人群的監(jiān)控主要基于血清學檢測，如CA153、CA125以及癌胚抗原，這些腫瘤標志物的診斷敏感度和特異性都較低，限制了其在臨床診療過程中對原發(fā)性乳腺癌早期診斷的應用價值[3]。國內有學者[4]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌篩查過程中，如果單獨使用某一個腫瘤標志物，敏感度不超過10%，而即使聯(lián)合多種標志物來篩查，敏感度最多達20%左右。因此，尋求乳腺癌血清學篩查的新型標志物成為研究的重點[5]。

近來研究發(fā)現(xiàn)，患者血漿miRNAs作為乳腺癌診斷標志物顯示出比傳統(tǒng)標志物更高的臨床應用價值[6－8]。Huang等[9]用 RNA深度測序技術檢測發(fā)現(xiàn)外泌體中存在一些長鏈非編碼（long chain noncoding，lnc）RNA，直接證實了外周血中存在 lncRNA。大多數(shù)學者認為乳腺癌患者血液中循環(huán)核酸是由癌細胞凋亡或壞死而釋放的[10－11]。肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）是長度約為8 700 nt，定位于人類染色體11q13.1的 lncRNA。MALAT-1在多種腫瘤細胞中呈高表達，如乳腺癌細胞，其高表達與細胞高增殖擴散能力相關[12－15]。近來研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達水平明顯高于乳腺良性疾病者[16]。但是，外周血中過表達的MALAT-1與乳腺癌基因分型的關系及其較傳統(tǒng)標志物CA153、CA125對乳腺癌的診斷價值尚不清楚。因此，本研究擬通過實時熒光定量PCR（qRTPCR）方法檢測MALAT-1在乳腺癌組織和血漿中的表達，分析血漿MALAT-1與各臨床病理特征的相關性以及對乳腺癌的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 標本收集

選取2016年1月至2017年8月在鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院及鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院乳腺外科行乳腺癌切除術患者60例；年齡為41～82歲，中位年齡50歲。所有患者術前均未接受過手術、放療及化療。共收集到60例配對的乳腺癌組織及癌旁組織（距腫瘤＞5 cm，經(jīng)病理檢查證實為正常乳腺組織且不伴雜質），離體30 min內保存于液氮罐中。選取同期在鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院行乳腺腫塊切除術，術后病檢確診為乳腺纖維瘤的女性患者60例，年齡29～67歲，中位年齡49歲。患者均簽署知情同意書，所有試驗均獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 組織 RNA提取試劑 RNAiso Plus及血漿 RNA提取試劑 RNAiso Blood，Prime-ScriptTMRTⅡ反轉錄試劑盒，SYBR?Premix ExTaqⅡ擴增試劑盒（大連寶生物TaKaRa公司）；lncRNA MALAT-1引物由廣州銳博生物科技公司合成；血漿CA153和癌胚抗原檢測試劑盒（瑞士Roche公司）。

1.2.2 主要儀器 C1000TM熒光定量PCR儀器、凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc TMXRS＋凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；微量分光光度儀（北京美林恒通儀器有限公司）；Cobas e601化學發(fā)光免疫分析儀（瑞士Roche公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 血樣采集及處理 所有患者于術前1 d采集空腹全血5 mL，于EDTA-K2抗凝管，2 000 r/min離心20 min，取血漿，于－80℃保存。

1.3.2 組織和血漿 RNA提取及反轉錄 采用RNAiso試劑提取組織與血漿中的RNA。行純度和完整性檢測，剔除不合格標本。采用試劑盒（Prime-ScriptTMRTⅡ）行反轉錄反應，以提取的總RNA為模板，反應總體積為20μL。加入相應試劑后于PCR儀內進行cDNA合成。產(chǎn)物于－80℃保存。

1.3.3 qRT-PCR檢測 MALAT-1的表達 MALAT-1引物序列及退火溫度見表1，GAPDH作為內參[11－13]。應用PCR擴增儀檢測每個擴增循環(huán)后SYBR?GreenⅠ熒光信號水平。20μL反應體系，反應條件：95℃預變性10min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。運用熔解曲線檢測擴增產(chǎn)物純度。采用相對定量2－ΔΔCt法計算表達量。

表1 引物序列和退火溫度

1.3.4 血漿CA125和CA153含量檢測 采用Cobas e601電化學發(fā)光免疫分析儀檢測血漿中CA125及CA153含量。CA125參考范圍為0～35 U/mL，CA153參考范圍為0～30 U/mL。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用 MedCalc 11.4.2.0繪制ROC曲線。非正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)±四分位數(shù)間距（M±QR）表示；兩組獨立樣本間比較采用Mann-WhineyU檢驗，兩組配對樣本間采用Wilcoxon符號秩和檢驗。采用Spearman秩相關系數(shù)檢驗兩個隨機變量之間的相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MALAT-1在乳腺癌組織和血漿中的表達

由圖1可見，乳腺癌組織MALAT-1表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝－6.737，P＜0.01）。乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達水平明顯高于纖維瘤患者，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝－9.449，P＜0.01）。

2.2 血漿與乳腺癌組織中MALAT-1表達的相關性

Spearman秩相關分析顯示，乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達水平與癌組織的表達水平呈一定的正相關（rs＝0.501，P＜0.01）。見圖2。

圖1 qRT-PCR檢測組織和血漿中MALAT-1的表達

圖2 乳腺癌組織和血漿中MALAT-1表達的相關性

2.3 乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達與臨床病理參數(shù)相關性

對乳腺癌患者的病理資料進行統(tǒng)計分析，結果顯示患者血漿MALAT-1表達水平與淋巴結轉移及基因分型相關，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）；與患者年齡、TNM分期、病理類型、雌激素受體、孕激素受體、cerbB-2、p53及 Ki67無相關性（P＞0.05）。見表 2、圖3。

表2 乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達與臨床病理參數(shù)的相關性 M±QR

續(xù)表2

圖3 MALAT-1在不同乳腺癌患者血漿中的表達

圖4 血漿中MALAT-1、CA125和CA153診斷乳腺癌的ROC曲線

2.4 血漿中MALAT-1對乳腺癌的診斷價值

由圖4可見，乳腺癌患者血漿中MALAT-1過表達曲線下面積（AUC＝0.961）明顯大于 CA125（AUC＝0.618，P＝0.022）和 CA153（AUC＝0.623，P＝0.016）。MALAT-1診斷敏感度和特異性高于CA125和CA153；聯(lián)合應用3項指標檢測的診斷敏感度高于各指標單獨檢測。見表3。

表3 各項指標單獨檢測和聯(lián)合檢測的敏感度和特異性

3 討論

MALAT-1具有調節(jié)細胞周期的功能，可通過提高B-Myb的表達使細胞從G1期向S期、G2期向M期轉變，從而促進腫瘤細胞增殖[12，17]。研究證明[18－19]，可根據(jù)外周血細胞中 MALAT-1表達的差異區(qū)分非小細胞肺癌患者和健康者，表明其可作為非小細胞肺癌的診斷和預后指標。MALAT-1與乳腺癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移有關。Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)高濃度 17β-雌二醇（E2）可使下游靶點MALAT-1表達水平下降，從而減弱MALAT-1對乳腺癌細胞增殖及侵襲轉移的影響。此外，有學者發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血漿MALAT-1水平較良性結節(jié)者明顯升高，其高表達可作為乳腺癌診斷的生物學標志物[13]。本研究結果進一步證實乳腺癌患者癌組織中MALAT-1表達較癌旁組織明顯增高，其血漿中MALAT-1水平較乳腺纖維瘤患者明顯增高。為更加明確血漿MALAT-1對乳腺癌的診斷價值，對乳腺癌患者血漿中高表達的MALAT-1及乳腺癌傳統(tǒng)標志物CA125和CA153繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)MALAT-1診斷敏感度和特異性高于CA125和CA153，聯(lián)合3項指標檢測的診斷敏感度高于各指標單獨檢測。此外，乳腺癌患者血漿MALAT-1水平與組織MALAT-1水平具有一定相關性，這些均表明血漿MALAT-1可能為乳腺癌診斷的潛在標志物。

本研究結果表明，血漿MALAT-1表達水平與基底樣型乳腺癌以及淋巴結轉移相關。近幾年采用基因表達和免疫組化的方法將乳腺癌分為LuminalA、LuminalB、cerbB-2過表達型和基底樣型四大類。其中，基底樣型乳腺癌又稱三陰性乳腺癌，指雌激素受體、孕激素受體和cerbB-2表達均為陰性的乳腺癌，約占所有乳腺癌患者15%，其生物學特點表現(xiàn)為侵襲性強，易出現(xiàn)淋巴結轉移，因缺乏內分泌及抗cerbB-2治療的靶點，此類乳腺癌患者預后較差[21－23]。后續(xù)我們將進一步研究MALAT-1對三陰性乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

綜上所述，血漿MALAT-1有望成為乳腺癌診斷的潛在分子標志物。后續(xù)將隨訪60例乳腺癌患者的預后來探索MALAT-1在乳腺癌中的臨床實用價值。

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