基于金納米材料的可視化生物傳感器的研究進展

馬小明+孫密+林悅+劉銀金+羅芳+郭隆華+邱彬+林振宇+陳國南

摘要可視化檢測方法是一種以光學響應信號為基礎，通過裸眼比較反應液中顏色的深淺或種類的變化，實現對目標物的肉眼識別檢測， 具有檢測結果可視化、操作簡單快捷、檢測成本低和響應速度快等優點。在各種納米材料中，金納米材料由于具有獨特的光學性質，被廣泛用于可視化傳感器的構建。當納米粒子之間的距離或形貌改變時，其局域表面等離子共振吸收峰會產生相應的變化，引起溶液顏色的改變。本文綜述了近幾年基于金納米材料的可視化傳感器在分析檢測中的研究進展，分析了該技術在實際應用中面臨的主要問題，并對未來的發展前景進行了展望。

關鍵詞金納米顆粒； 可視化傳感器； 評述

1引 言

金納米顆粒具有良好的穩定性，能夠被長期保存，同時，通過改變合成方法能夠制備出各種不同形貌、不同尺寸的納米顆粒[1～]。金納米顆粒具有較高的摩爾吸光系數（5

SymboltB@ 1010 L/（mol·cm）），比傳統的顯色染料高3～個數量級[5]。這使得基于金納米顆粒的比色分析方法的檢測靈敏度可以達到納摩爾級別，檢出限遠低于傳統的比色分析方法[6]。同時，金納米顆粒具有獨特的局域表面等離子體共振（Localized surface plasmon resonance，LSPR）特性，當材料的形貌、表面性質、反應環境或顆粒之間的距離發生改變時，其紫外可見吸收峰會發生變化，同時溶液的顏色也會相應地改變[7，8]。因此可以采用金納米顆粒的顏色變化作為響應信號，依靠肉眼對信號進行讀取識別，達到可視化檢測的目的。自1997年Mirkin首次提出以金納米顆粒為可視化檢測的顯色底物，基于金納米顆粒可視化分析檢測方法開始有了突破性的進展，隨后被廣泛用于核酸、蛋白質、離子、有機物和細胞等物質的檢測中[9～12]。此外，金納米顆粒具有優異的催化活性，能夠催化顯色底物產生顏色變化，從而實現待測物的可視化分析檢測[13]。因此，基于金納米材料的可視化生物傳感器不僅能滿足高靈敏的檢測需求，同時具有操作簡單、信號響應速度快、檢測結果直觀、不需要額外的輔助設備等優點，尤其適合于現場快速檢測和實驗條件較為落后等區域。

2基于金納米材料距離變化的可視化分析法

金納米顆粒之間距離的變化會引起LSPR的改變，從而產生溶液的顏色差異，因此可以根據金納米顆粒的空間距離變化構建可視化傳感器[1]。基于金納米顆粒“距離變化”的可視化分析方法主要有交聯聚集和非交聯聚集。交聯聚集主要是在金納米顆粒表面上修飾不同的識別分子（如DNA、抗體、小分子等），通過目標物與識別分子之間特異性的識別作用（如DNA雜交、抗原抗體特異性識別、金屬配體絡合作用等），拉近金納米顆粒之間的距離，溶液的顏色由紅色轉變為藍色[15～18]。非交聯聚集主要是通過改變金納米顆粒的表面性質而引起的，如改變p值、離子強度、溶劑成分等[19，20]。

21交聯聚集檢測

通過AuS共價鍵將DNA修飾到金納米顆粒的表面，利用堿基互補配對作用或核酸適配體對目標分子的特異性識別，實現了DNA、miRNA或小分子的可視化檢測。如圖1A所示，通過不對稱修飾的方法在金納米顆粒表面上分別修飾上兩條不同序列的DNA，當存在目標DNA時，DNA之間通過堿基互補配對形成Y型結構，拉近了金納米顆粒之間的距離，溶液的顏色由紅色變為藍色。值得注意的是，與傳統通過DNA誘導金納米顆粒聚集產生大量的團聚物不同，該方法形成了金納米顆粒二聚體結構，減少了非響應性雜交，間接提升了金納米顆粒的利用率，實現了對于pmol/L級別DNA的檢測[21]。將探針序列替換成對于赭曲霉毒素A（OA）具有特異性識別的核酸適配體序列，便能實現小分子目標物的可視化檢測[22]。此外，將金納米顆粒不對稱修飾技術與雙鏈特異性核酸酶（DSN）循環擴增技術結合，也能實現miRNA的超靈敏可視化分析檢測，檢出限達05 fmol/L（圖1B）[23]

在金納米顆粒表面上功能化不同的反應基團，通過目標物與反應基團之間的特異性反應，可實現對目標物的可視化檢測[2，25]。hou等[26]分別制備了修飾有炔基和疊氮基團的金納米顆粒，通過抗壞血酸鈉將Cu2+還原為Cu+，觸發點擊化學反應，拉近金納米顆粒之間的距離，實現了對Cu2+的可視化分析檢測，檢出限為50

SymbolmA@ mol/L。在此基礎上，Qu等[27]將氧化銅納米顆粒代替傳統的酶標記物修飾到二抗上，經過免疫反應后，二抗上的氧化銅納米顆粒酸溶解之后生成Cu2+，隨后用還原劑將Cu2+還原為Cu+觸發點擊化學反應，實現了對抗原的可視化分析檢測（圖2A）。此外，采用堿性磷酸酶（ALP）標記的檢測抗體也能實現抗原的可視化檢測，酶催化水解底物抗壞血酸磷酸酯鈉（AAp）生成抗壞血酸，將Cu2+定量地還原為Cu+，隨后經過點擊化學反應，金納米顆粒發生團聚，溶液顏色由紅色變為藍色（圖2B）[28]。

圖2（A）基于CuO標記的抗體和點擊化學引發AuNPs聚集的可視化免疫測定[27]； （B）基于ALP酶促反應和點擊化學反應誘導AuNPs聚集的可視化免疫測定[28]

ig2（A） AuNPsbased immunoassay with combination of CuO labeled antibody and click chemistry[27] （B） Visual immunoassay of AuNPs based on clicking chemical reaction triggered by alkaline phosphatase （ALP） enzymatic reaction[28]

未經過功能化修飾的金納米顆粒也能通過誘導聚集，縮短納米顆粒之間的距離，達到可視化檢測的目的。Liu等[29]報道了一種基于乙酰膽堿酯酶催化水解產物誘導金納米顆粒聚集的可視化檢測方法，實現了對腸病毒71型（EV71）的高靈敏檢測。 該方法以乙酰膽堿酯酶作為酶標記物，催化水解乙酰膽堿生成硫代乙酰膽堿； 硫代膽堿通過AuS共價鍵鍵合到金納米顆粒表面。在靜電作用的誘導下， 金納米顆粒聚集，溶液的顏色由紅色變為藍色。此外，Liu等[30]發現乙酰膽堿酯酶的催化活性會被有機磷和氨基甲酸酯農藥抑制，因此基于上述原理構建的可視化傳感器也能用于農藥殘留物的檢測（圖3）。endprint

22非交聯聚集檢測

由于DNA具有帶負電荷的磷酸骨架，將單鏈DNA修飾到金納米顆粒表面可以提高粒子之間的靜電排斥力，增強其穩定性并能在高鹽離子濃度下穩定存在。然而，當DNA的空間結構發生變化時，DNA會遠離金納米顆粒表面。由于失去DNA的保護，金納米顆粒在高鹽離子濃度中的穩定性會急速下降，形成大量團聚體[31]。hao等[32]發現修飾有DNA的金納米顆粒能夠在高鹽離子濃度下保持穩定，溶液的顏色為紅色，但是當加入脫氧核糖核酸酶I將DNA水解后，在相同的離子強度下，由于缺乏DNA保護，金納米顆粒形成聚集體，通過肉眼就能觀察到明顯的顏色變化。Liu等[33]發現發夾DNA也能有效地吸附在金納米顆粒表面，防止金納米顆粒在高鹽濃度下發生聚集。當存在有目標DNA時，原本吸附在金納米表面的發夾DNA會與目標物結合，引發雜交鏈式反應，最終形成較長序列的雙鏈DNA，

遠離金納米顆粒表面，因此在高鹽濃度下金納米顆粒發生聚集，溶液的顏色由紅色變為藍色（圖A）。基于非交聯聚集的可視化檢測方法也能用于小分子的檢測，Yang等[3]報道了OA適配體包裹的金納米顆粒能夠在高鹽離子濃度下穩定存在，當存在有目標物時， OA會與適配體結合形成G四鏈體，遠離金納米顆粒表面，因此在高鹽濃度下溶液的顏色由紅色變為藍色，依據溶液的顏色變化實現對20 nmol/L OA分子的可視化檢測（圖B）。此外，可以通過溶液酸堿度變化構建可視化傳感器，富含C堿基的DNA序列在不同酸堿度中呈現出不同的結構，在不同的p值下， 當DNA的結構發生改變，金納米顆粒由于失去DNA的保護而聚沉，溶液的顏色由紅色變為藍色[35]。

圖（A）基于雜交鏈式反應的免酶催化金納米顆粒可視化檢測DNA[33]； （B）基于適配體金納米顆粒可視化傳感用于OA的檢測[3]

ig（A） Enzymefree colorimetric detection of DNA by using Au nanoparticles and hybridization chain reaction amplification[33] （B） Aptamerbased colorimetric biosensing of Ochratoxin A using unmodified gold nanoparticles indicator[3]

3基于金納米材料形貌變化的可視化分析法

31基于金納米顆粒生長的可視化分析檢測

通過調控金納米顆粒的生長過程，金納米材料的形貌變化也會導致LSPR的改變， 根據溶液的顏色變化也可以構建可視化傳感器[36]。如圖5A所示，Rica等[37]通過控制金納米顆粒生長過程中形貌變化實現血清中前列腺特異性抗原（PSA）和艾滋病病毒（IV1）的可視化檢測。該方法采用修飾在酶標板上的捕獲抗體對目標物進行識別，隨后與修飾過氧化氫酶的檢測抗體形成抗原抗體三明治夾心結構。當不存在目標物時，大量的雙氧水（2O2）與氯金酸（AuCl）發生反應，加快了金納米顆粒的生長速度，最終形成球形的、非聚集的紅色金納米顆粒。反之，過氧化氫酶會催化分解2O2成水和氧氣，減緩晶體的生長速率，導致金納米顆粒不對稱生長，溶液的顏色為藍色。通過肉眼識別溶液的顏色變化，實現了目標物的超靈敏可視化檢測，檢出限可達1 Symbolm@@ 18 g/mL[37，38]。Peng等[39]基于類似的機理，采用免疫競爭法實現了對甲基睪酮的可視化檢測，檢測靈敏度與傳統方法相比提高了50倍。

圖5（A）基于等離子體ELISA用于超靈敏可視化檢測癌癥標志物[37]； （B）基于乙醛脫氫酶催化金納米顆粒生長的可視化檢測[1]； （C）基于葡萄糖氧化酶催化金納米顆粒生長用于肺癌癌癥標志物的檢測[2]； （D）基于目標物介導的適配體功能化的金納米顆粒生長用于復雜樣品中小分子目標物的可視化檢測[3]

ig5（A） Plasmonic ELISA for ultrasensitive detection of disease biomarkers with naked eyes[37]； （B） Alcohol dehydrogenasecatalyzed gold nanoparticle seedmediated growth allows reliable detection of disease biomarkers with the naked eye[1]； （C） Glucose oxidasecatalyzed growth of gold nanoparticles enables quantitative detection of attomolar cancer biomarkers[2]； （D） Colorimetric detection of small molecules in complex matrixes via targetmediated growth of aptamerfunctionalized gold nanoparticles[3]

通過種子介導生長法，控制金納米顆粒生長成不同形貌、尺寸的納米顆粒，也能實現可視化檢測[0]。Peng等[1]開發了一種基于乙醇脫氫酶催化分解反應來控制金納米顆粒生長的可視化分析方法（圖5B）。該方法以乙醇脫氫酶為酶標記物，以乙醇、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、晶種（5 nm）和AuCl為酶促反應底物。當存在目標物時，抗體上標記的乙醇脫氫酶會將NAD+和乙醇催化分解生成還原型輔酶I（NAD）和乙醛。反應生成的NAD將AuCl還原生成金單質，并在金核（5 nm）上不斷地沉積生長，溶液的顏色發生明顯的變化[1]。Liu等[2]以葡萄糖氧化酶為催化劑，催化分解葡萄糖生成2O2和葡萄糖酸，2O2將AuCl還原生成金單質并不斷地在金核（5 nm）上面生長，金納米顆粒的尺寸不斷變大，溶液的顏色由無色變為紅色，實現了PSA的高靈敏可視化檢測，檢出限達93 amol/L（圖5C）。Soh等[3]在金納米顆粒表面修飾上OA的核酸適配體序列，如圖5D所示，當加入OA時，OA與適配體發生特異性結合，并遠離金納米顆粒隨后加入羥胺（N2O）將AuCl還原成金單質并在原始的金種上均勻地生長，溶液顏色為紅色； 反之，DNA包裹的金納米顆粒產生不均勻的生長，溶液的顏色為藍色。通過肉眼便能實現OA的可視化分析檢測，檢出限為1 nmol/L。endprint

在金納米顆粒表面沉積上不同的貴金屬材料，形成核殼結構，由于材料表面折射率或尺寸的改變所引起金納米材料的LSPR變化，也能用于可視化傳感器的構建。hou等[]采用ALP催化分解AAp生成具有還原性的抗壞血酸，將銀離子還原生成銀單質，并不斷在金核（6 nm）上進行原位生長，形成銀包金的核殼結構。由于銀納米材料具有較高的摩爾吸收系數，可以實現禽流感病毒的高靈敏可視化檢測，檢出限為175 pg/mL（圖6A）。采用不同形貌的金納米材料也能用于可視化傳感器的構建，其中金納米棒由于具有獨特的LSPR光學特性，不同長徑比的金納米棒溶液呈現出不同的顏色，因此基于此原理構建的可視化傳感器能夠實現多種顏色變化，提高肉眼的識別能力[5， 6]。基于酶催化誘導銀離子原位生長的思路，Gao等[7]報道了一種多色彩可視化檢測方法，如圖6B所示，銀離子在金納米棒表面不對稱生長，改變了金納米棒的長徑比，其LSPR峰發生移動，溶液的顏色呈現豐富多彩的變化。將金納米棒替換成金納米雙錐，調控反應條件在其表面上原位生長銀單質，也能實現多色彩可視化檢測，并且該方法的檢測靈敏度相比于以金納米棒的顯色方法提高了3個數量級，通過裸眼識別不同的溶液顏色，便可以對待測物進行半定量分析檢測[8]。此外，其它形貌的金納米材料（如金納米籠）也能通過原位生長形成金核銀殼的結構，產生豐富多彩的顏色變化，實現可視化傳感器的構建[9]。

32基于金納米顆粒刻蝕的可視化分析檢測

雖然基于納米顆粒原位生長的可視化檢測方法具有較好的靈敏度，但是由于反應過程中反應體積、反應容器和氯金酸的質量等外界條件的差別，會導致檢測結果呈現假陽性或假陰性信號。此外，不同的操作者進行同一組實驗時，檢測結果也有可能存在顯著性差異，例如加樣的速度或順序的區別也會直接影響實驗結果[50]。因此，可以預先制備納米材料，進行選擇性氧化刻蝕，提高檢測結果的穩定性。

Saa等[51]發現高濃度的辣根過氧化物酶（RP）在2O2的存在下， 有效地氧化刻蝕金納米棒，使得金納米棒的長徑比變小。將該反應與葡萄糖氧化酶催化體系相結合，通過對比反應前后溶液顏色種類的變化，實現血糖的可視化檢測。hang等[52]研究發現在弱酸性條件下，鉬酸鹽能夠催化2O2和I

Symbolm@@ 生成I2，I2對金納米棒進行氧化刻蝕，使得金納米棒的長徑比發生改變，溶液呈現不同種類的顏色變化（圖7A）。通過芬頓反應氧化刻蝕金納米棒也能用于可視化傳感器的構建，如圖7B所示，隨著2O2濃度的增加，金納米棒的LSPR峰逐漸藍移，溶液的顏色呈現豐富多彩的變化，采用過氧化氫酶作為酶標記物，控制反應過程中2O2的含量，實現了甲胎蛋白、黃曲霉毒素B1和miRNA的多色彩可視化檢測[53]。在傳統的顯色體系中，3，3'，5，5'四甲基聯苯胺（MB）由于具有靈敏度高、顯色結果穩定、無致癌性等優點被廣泛用作于顯色底物。研究發現，顯色反應產物MB2+會與金納米棒發生氧化還原反應，金納米棒的長徑比逐漸減小，溶液呈現豐富多彩的顏色（圖7C）。因此只需在傳統商業化酶聯免疫試劑盒的基礎上，加入金納米棒參與反應， 便能一步實現多色彩可視化檢測。 該方法對于癌胚抗原（CEA）和PSA的可視化檢出限分別為25 ng/mL和75 pg/mL，實際樣品檢測結果與傳統方法相近，具有簡便、快捷、易于商品化等優點[5]。

基于金納米材料模擬酶性質的可視化分析法

研究表明，許多金納米材料具有模擬酶活性（如葡萄糖氧化酶活性、辣根過氧化物酶活性、過氧化氫酶活性等），被廣泛應用于可視化傳感器的構建[55～62]。Comotti等[63]最早發現當存在有氧氣時，金納米顆粒可以催化葡萄糖分解生成葡萄糖酸和2O2，相比于其他貴金屬（如，銅、銀、鈀和鉑等）納米材料，金納米顆粒具有較強的葡萄糖氧化酶催化活性。heng等[6]構建了一種金納米顆粒自催化生長法，金納米顆粒通過催化葡萄糖分解并不斷在金納米顆粒表面原位生長，改變了納米顆粒的界面性質，實現了DNA的可視化檢測（圖8A）。

此外，金納米顆粒也具有RP的活性[65～68]，金納米顆粒在催化反應過程中，將2O2吸附到金納米材料的表面，此時2O2中的OO化學鍵會被打開，形成羥基自由基，繼而氧化MB發生顏色變化[65]。例如，ao等[66]利用帶正電荷的金納米顆粒所具有辣根過氧化物酶催化活性，催化MB氧化生成MB+，溶液的顏色發生改變，研究發現多巴胺會抑制金納米顆粒模擬的酶催化活性，因此可以構建可視化傳感器用于多巴胺的檢測。Wang等[67]發現半胱氨酸也會抑制金納米顆粒的RP催化活性，通過半胱氨酸與水中的g2+進行特異性結合，建構了可視化傳感器用于g2+和半胱氨酸檢測。

5金納米材料在其它可視化傳感中的應用

便攜性檢測設備（POC）具有使用方便快捷，不需要熟練的操作技術人員等優點，已經被廣泛投入到市場應用（如血糖儀、免疫試紙條等），并且在現場分析檢測和居家理療等領域發揮巨大作用[69～71]。膠體金試紙由于無需專業儀器、檢測耗時短、具有較好的特異性和靈敏度、便于運輸和儲存和檢測結果可視化等優點，得到了廣泛的應用。然而，與傳統的分子檢測技術相比，它的檢測靈敏度較差，不能滿足高靈敏檢測的需求。為了提高檢測的靈敏度，Mao等[72]研制了一種基于RP酶催化信號放大的分析方法用于DNA的檢測，通過酶催化產生紅色的不溶物并不斷沉積到金納米顆粒表面，加深了顏色的強度，提高了肉眼可視化分辨能力，因此增強了檢測的靈敏度，對于DNA的檢測范圍可以達到05 nmol/L ～ 50 pmol/L。通過優化RP的結合量以及檢測步驟，構建的RPAuNPs雙重標記方法能檢測到001 pmol/L DNA[73]。通過還原劑將金/銀離子還原形成原子，并在膠體顆粒周圍形成直徑為5～10 μm的納米簇，也可用于可視化傳感器的構建，該方法使得膠體金的直徑提高了100倍，極大地提高了檢測靈敏度。Li等[7]以N2OCl為還原劑，通過氧化還原反應將AuCl還原為金納米簇并組裝到金納米顆粒的表面上，金納米顆粒的尺寸變大，檢測靈敏度相比于傳統方法提高了10～100倍。endprint

此外，通過誘導功能化的金納米顆粒團聚，也能作為一種有效的信號擴增技術應用于膠體金免疫層析法中。例如，e等[73]介紹了一種基于DNA雜交介導的金納米顆粒團聚的信號擴增方法。該方法首先采用同時標記有檢測抗體和cDNA的金納米顆粒，通過抗體對目標抗原的特異性識別對使得金納米顆粒在檢測線上富集。隨后加入修飾有與cDNA互補的金納米顆粒，與原先的金納米顆粒發生DNA雜交，形成大量的金納米顆粒團聚體，極大地提高了檢測的靈敏度。Chapman等[75]將生物素修飾的高聚物包裹于脂質體中，當存在有磷脂酶時，脂質體會被催化分解，生物素修飾的高聚物會被釋放出來并與結合板中的金納米顆粒發生反應，使得金納米顆粒發生聚集。金納米顆粒聚集體在檢測線處被特異性的捕獲，極大提高了檢測的靈敏度。該反應在10 min內便能實現對磷脂酶的可視化檢測，檢出限達1 nmol/L（圖9）。

6結論與展望

金納米材料因其獨特的光學特性，在可視化生物傳感器的構建中展現出良好的應用潛力。基于金納米材料的不同顯色機制在可視化檢測中得到廣泛的應用， 從常見的紅色到藍色的雙色變化發展為多種色彩顏色變化，擴大了可視化檢測的應用范圍。然而，將這些方法應用于商業化檢測仍需要大量的努力。首先，大批量合成具有較高的均一性和穩定性的金納米材料較為困難，目前所采用的合成方法較為繁瑣，對實驗人員的合成水平有一定要求，同時存在較大的批間差異，無法實現大規模商業化生產。其次，有些檢測方法的檢測靈敏度不能滿足高靈敏檢測的需求，仍需要借助于傳統方法的輔助。此外，大多數的顯色體系均在溶液中進行反應，在檢測過程中容易受到外界環境變化的影響，不適于家居便攜式測定。對于金納米顆粒穩定性、均一性問題，可以通過提高合成技術手段、改進合成設備，實現大批量的金納米顆粒材料的制備，此外，通過在對納米材料進行功能化修飾也能提高其穩定性。在檢測靈敏度方面，可以通過引入信號放大系統（如酶催化信號放大、循環擴增反應等），提高檢測的靈敏度。最后，可以借鑒膠體金試紙條的思路，將反應體系由液相轉移至固相載體上，提高使用的便攜性。隨著科技的進步，基于金納米材料的可視化傳感器在未來一定會有更為廣闊的應用前景。

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AbstractVisualization detection methods are used for determination of the concentration of unknown target by comparing the color change in the intensity or type of reaction solution by naked eye Visualization detection method has some advantages such as simple and rapid operation， low detection cost， fast reaction speed， and detecting target concentration by means of naked eye Gold nanomaterials are widely used in the construction of visual biosensors due to its unique optical properties or example， when changing the distance or morphology of the particles， the plasmon resonance absorption peak of local surface will change accordingly erein， we reviewed the application of gold nanomaterials in visualization biosensors for the detection of target molecules， summed up the main problems of AuNP colormertic methods in the determination of actual samples， and provided an outlook of the future of gold nanoparticlesbased biosensor in application development

KeywordsGold nanoparticles； Visualization biosensor； Review

（Received 1 uly 2017； accepted 20 September 2017）

his work was supported by the National Natural Science oundation of China （Nos 21575027， 21575025）endprint