固相萃取—高效液相色譜—二極管陣列檢測器法同時測定湖水中種藍藻毒素

田丙正 張敏+張付海+趙彬+王鑫+朱超

摘要建立了固相萃取高效液相色譜二極管陣列檢測器法測定湖水中10種藍藻毒素（MCRR、MCYR、MCHtyR、MCLR、MCWR、MCLA、MCLY、MCLW、MCLF和NOD）的方法。水樣經固相萃取凈化后，用Waters PAH C18 （250 mm×46 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈和含005%三氟乙酸為流動相梯度洗脫，流速為08 mL/min， 柱溫為30℃，進樣量為20 μL，二極管陣列檢測器檢測范圍190～300 nm，檢測波長為238 nm。根據保留時間、二極管陣列檢測器全掃描光譜和色譜峰純度分析等進行定性分析。10種藍藻毒素在005～200 mg/L濃度范圍內線性關系良好，線性系數R為09998～09999，方法檢出限為0005～0020 μg/L。3個濃度加標水平（01、10和18 mg/L）的回收率為851%～1053%，相對標準偏差為08%～92%。本方法適用范圍廣、操作簡單、分析速度快、靈敏度高、重現性和回收率好，采用多重定性增強了定性分析的準確性，可用于實際湖水中10種藍藻毒素的測定。

關鍵詞高效液相色譜； 二極管陣列檢測器； 固相萃取； 藍藻毒素； 水

1引 言

隨著環境污染和水體富營養化程度加劇，水體中有害藻類水華尤其是藍藻水華頻繁發生。世界上25%～70%的藍藻水華污染可產生藻毒素[1]，其在水環境中的污染特征[2，3]和對人體健康危害[4]一直備受關注。藍藻毒素分為肝毒素[5]、神經毒素[6]和其它毒素，其中肝毒素又包括微囊藻毒素（Microcystin，MC）、節球藻毒素（Nodularin，NOD） [7]和柱孢藻毒素（Cylindrospermopsin，CYN） [8]。在已發現的各種不同藻毒素中，微囊藻毒素是一種在藍藻水華污染中出現頻率最高、產生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素[9]，微囊藻毒素目前已發現90多種異構體[10]，其污染已經成為全球性的環境問題[11]。節球藻毒素致毒機理與微囊藻毒素相似，中毒癥狀和危害也類似。

藍藻毒素的檢測方法主要有酶聯免疫法[12]、分子生物學法[13]、高效液相色譜法[14]和液相色譜質譜聯用法[15～17]等。酶聯免疫法專屬性不強，只能測定藻毒素總量，無法識別MC個體；分子生物學法檢測易出現假陽性結果；液相色譜串聯質譜法靈敏度高，但儀器昂貴、普及率不高、操作繁瑣，檢測成本高。二極管陣列（PDA）檢測器兼顧了高靈敏度和準確度，Edwards等[18]發現二極管陣列檢測器對微囊藻毒素進行純度檢測得到的結果更精確。液相色譜法較為普遍、簡單快速，是世界衛生組織和我國推薦的標準分析方法。目前，世界衛生組織僅對水中微囊藻毒素MCLR的限量水平做出規定，其暫行限量值為0001 mg/L[19]，對于其它藍藻毒素在水中的限量要求沒有準則水平。我國在地表水環境質量標準（GB38382002）集中式生活飲用水地表水源地特定項目標準限值中規定了微囊藻毒素LR限量值為0001 mg/L[20]，也未對其它藍藻毒素做出規定。

目前，測定藍藻毒素的方法主要還是只針對微囊藻毒素[21，22]或節球藻毒素[23]分別進行，研究多涉及微囊藻毒素，檢測的微囊藻毒素種類有限；對節球藻毒素的分析研究很少。作為兩類危害嚴重的藻毒素，微囊藻毒素和節球藻毒素的同時檢測尤為重要，復雜的水體環境又要求檢測盡可能多的藻毒素，目前使用液相色譜二極管陣列檢測器法對微囊藻毒素和節球藻毒素的同時檢測和多種類檢測鮮有報道。本研究通過優化樣品前處理和色譜條件，建立了固相萃取液相色譜二極管陣列檢測器法同時測定湖水中10種藍藻毒素的方法。本方法適用性廣、操作簡單、分析速度快、重現性好和靈敏度高，定性更可靠，定量更準確，為全面了解富營養化水體中藍藻毒素的污染狀況提供了科學的分析方法。

2實驗部分

21儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括四元泵、在線真空脫氣機、柱溫箱、自動進樣器和二極管陣列檢測器（美國Waters公司）； MilliQ Integral 115超純水系統（美國Millipore公司）；AQUA Trace ASPE 799固相萃取儀（日本ShimadzuGL公司）；MultiVap8全自動定量濃縮儀（美國LabTech公司）。Waters Oasis HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL，美國Waters公司）。三氟乙酸（TFA，色譜純，美國Dikma公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck公司）；10種藍藻毒素標準品MCRR、MCYR、MCHtyR、MCLR、MCWR、MCLA、MCLY、MCLW、MCLF和NOD（純度≥995%，瑞士ENZO Life Sciences公司）。

22色譜條件

Waters PAH C18色譜柱（250 mm × 4 6 mm，5 μm）； 流動相A為005% TFA溶液，流動相B為乙腈。 梯度洗脫程序： 0～18 min， 31% B； 18～35 min， 31%～70% B； 35～36 min， 70%～31% B； 36～40 min， 31% B。 流速為08 mL/min； 柱溫為30℃， 進樣量為20 μL。 二極管陣列檢測器檢測范圍190～300 nm， 帶寬12 nm， 檢測波長為238 nm。

23標準曲線溶液的配制

取10種藍藻毒素標準品，用甲醇配制成濃度為10 mg/L的標準儲備液，用20%甲醇溶液逐級稀釋成005、020、050、100和200 mg/L的系列混合標準溶液。

24樣品采集和前處理

采集湖泊湖區表層水樣置于棕色玻璃瓶中，錫箔紙包裹后冷藏保存，當天送回實驗室。先經500目不銹鋼篩過濾，除去水樣中浮游生物和懸浮物；再取過濾后的水樣依次經GF/C玻璃纖維濾膜和045 μm乙酸纖維濾膜減壓過濾。固相萃取程序：先將HLB固相萃取柱用10 mL甲醇和10 mL水活化，然后將1000 mL過濾水樣以10 mL/min的流速在HLB柱上樣，富集完畢后依次用10 mL水和10 mL 20%甲醇溶液淋洗，再用20 mL含01%三氟乙酸的甲醇溶液洗脫，洗脫液氮吹濃縮至近干，用1 mL 50%甲醇溶液定容后，過045 μm微孔濾膜，待測。endprint

25定性與定量分析

在樣品與標準品的色譜保留時間定性基礎上，與二極管陣列檢測器全掃描光譜定性和色譜峰純度分析相結合，采取多重定性方法。以外標法對10種藍藻毒素進行定量分析。

3結果與討論

31樣品前處理條件的選擇

311固相萃取（SPE）柱的選擇水中藍藻毒素的萃取和凈化多采用C18柱和HLB柱[24]，本研究對比了Waters SepPak C18柱和Waters Oasis HLB柱對10種藍藻毒素的提取效率，發現兩者的平均提取率分別超過80%和85%，這是因為HLB固相萃取柱以N乙烯基吡咯烷酮二乙烯基苯共聚物為固定相，與多數有機溶劑兼容，穩定性好，吸附容量更高，保留能力更強。因此，本研究選擇Waters Oasis HLB柱進行藍藻毒素的萃取和凈化。

312洗脫液的選擇文獻[24]報道，使用75%以上的甲醇洗脫液即可將目標物大部分洗脫下來，但100%甲醇洗脫MCRR的回收率近乎為0。本研究在100%甲醇中加入01% TFA作為洗脫液，發現10種藍藻毒素的回收率均可達到90%以上。 這可能是加入TFA后，酸性條件可促進藍藻毒素中多肽質子化，減少目標物與萃取柱表面的相互作用，更易洗脫，同時還會減少雜質洗脫， 降低色譜峰干擾，且在樣品濃縮時由于沒有水相，減少了濃縮時間。因此，本研究選擇100%甲醇中加入01% TFA作為洗脫液。

32色譜條件的選擇

321二極管陣列檢測器多重定性和檢測波長的選擇水體環境復雜，樣品基質可能與目標物共流出，保留時間相近，僅依據保留時間定性易出現假陽性結果。二極管陣列檢測器可以得到紫外全波長掃描圖，用于確證藍藻毒素的存在和鑒定其種類。比較二極管陣列檢測器待測樣品和藍藻毒素標準品的掃描光譜圖和最大吸收波長，還可進行色譜峰純度分析，采取多重定性分析方法，增強定性分析的準確性，排除基質干擾和假陽性結果。

利用二極管陣列檢測器的在線3D掃描功能，在190～300 nm范圍內對10種藍藻毒素進行紫外吸收掃描。結果表明，MCRR、NOD、MCYR、MCHtyR、MCLR和MCWR的紫外全波長掃描圖基本相同，特征紫外吸收波長在232～240 nm；MCLA和MCLY的紫外全波長掃描圖與上述6種差別較大，特征紫外吸收波長在238 nm附近；MCLW和MCLF的紫外全波長掃描圖相互差別較小，其中MCLW在225和240 nm有兩個特征吸收波長，MCLF的特征吸收波長為239 nm。10種藍藻毒素在波長238 nm附近有較強的紫外吸收，故本研究選擇238 nm作為10種藍藻毒素通用的定量檢測波長。

322色譜柱的選擇高效液相色譜法常用的反相色譜柱多為C18柱，由于MCYR和MCHtyR疏水性非常接近，使用普通C18色譜柱無法實現有效分離[14]。本研究采用了Waters PAH C18色譜柱（250 mm × 4 6 mm， 5 μm）對10種藍藻毒素進行分析，結果表明，此色譜柱可將MCYR和MCHtyR有效分離，且分離度較好，其它目標物也分離良好，色譜峰對稱且基線平穩。

323流動相體系的選擇高效液相色譜測定藍藻毒素的流動相體系一般由乙腈/水或甲醇/水和緩沖溶液組成。通過比較乙腈/水和甲醇/水兩種體系發現，乙腈的基線噪音更小，分析時間更短，分離效果更佳，因此選用乙腈/水作為流動相體系。由于藍藻毒素呈中性或帶有負電荷，使用緩沖液保持流動相酸性，可抑制藍藻毒素電離，改善峰形，增加響應值，提高分離效果。本研究分別以三氟乙酸和磷酸鹽作為緩沖溶液進行對比實驗，結果表明，兩種緩沖液條件下10種藍藻毒素均能較好分離。流動相中加入TFA，分離度更好，基線更穩定，作為離子對可促進洗脫，TFA易揮發、紫外背景吸收小，可減少分析干擾。考慮到配制磷酸鹽緩沖液調節pH值較為繁瑣，磷酸鹽易析出鹽分造成系統堵塞等原因，本研究選擇乙腈/TFA溶液作為流動相。

324流動相淋洗方式的選擇流動相采用等度淋洗時能較好分離較早出峰的MCRR、NOD、MCYR、MCHtyR、MCLR組分，但較晚出峰的MCWR、MCLA、MCLY、MCLW、MCLF卻很難分開。實際水樣中可能存在色素等大分子及其它雜質，這些物質的出峰時間與溶劑和目標物的出峰時間可能接近，會影響目標物的分析。本研究考察了流動相不同初始比例（即005%TFA溶液與乙腈的比例）對10種藍藻毒素分離效果的影響。發現不同初始比例對較早出峰的MCRR、NOD、MCYR、MCHtyR、MCLR等組分影響較大，特別是MCYR和MCHtyR的分離有更大影響。提高005%TFA溶液的比例對較早出峰的上述物質分離有利， 005%TFA溶液與乙腈的體積比達到69∶31時，上述物質分離良好，其中MCYR和MCHtyR可完全分離，因此流動相選用005%TFA乙腈（69∶31，V/V），其它梯度淋洗優化后的條件詳見22節。結果表明，當采用梯度洗脫淋洗時，各組分在35 min內實現良好分離，分離度滿足相關要求，色譜峰對稱且基線平穩。梯度淋洗使目標物的出峰時間延后，能避免實際樣品中大分子物質和其它雜質對藍藻毒素測定的干擾。

325流動相酸度的選擇向流動相中加入一定量的酸，有助于提高各組分的分離效果[25]。本研究向水相中加入不同體積分數的TFA（001%、 002%、 005%、 008%、 010%），考察其對10種藍藻毒素的分離情況影響。結果表明，10種藍藻毒素的保留時間隨TFA體積分數的增加而推遲，峰面積隨TFA體積分數的而變化情況如圖1所示，MCWR、MCLF、MCLA、MCLY、MCLW的變化較明顯，峰面積隨TFA體積分數增加而增加，當TFA體積分數達到005%后趨于穩定；MCLR在很小范圍內波動；NOD、MCRR、MCHtyR、MCYR變化不明顯。綜合考慮，最終選擇005%TFA溶液作為水相流動相。endprint

326流動相流速的選擇分別考察了流動相流速為06、07、08、09和10 mL/min時分離效果。結果表明，隨著流速增大，峰面積降低，峰寬變窄，保留時間縮短，分離效果變好，綜合考慮峰面積、保留時間和分離度等因素，最終流動相流速選擇08 mL/min。在上述優化的色譜條件下，10種藍藻毒素的標準色譜圖見圖2。

33標準曲線與檢出限

以質量濃度（x，mg/L）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到10種藍藻毒素的線性方程及其相關系數，見表1。結果表明，在005～200 mg/L濃度范圍內，10種藍藻毒素的線性關系較好，相關系數（R）為09998～09999，完全滿足定量分析的要求。

在不含目標化合物的空白水樣中進行低濃度加標實驗，按照上述方法進行前處理和進樣分析，以3倍信噪比計算得到本方法中10種藍藻毒素的檢出限為0005～0020 μg/L，定量限為0016～0066 μg/L（表1）。我國地表水環境質量標準（GB38382002）[20]中僅規定了MCLR的限值為10 μg/L，對其它藍藻毒素未做限值規定，本實驗對MCLR的檢出限為0020 μg/L，低于我國地表水環境質量標準中MCLR限值10 μg/L近兩個數量級，說明本方法具有很高的靈敏度。

34回收率和精密度

選用不含10種待測組分的湖水樣品，分別添加低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液，配成01、10和18 mg/L的加標水樣，按照上述方法進行前處理，每個加標水平平行測定6次，加標回收率為851%～1053%，相對標準偏差為08%～92%（見表2），說明本方法有較高的準確度和精密度，適合實際樣品10種藍藻毒素的檢測分析。

35湖水樣品分析

利用本方法測定華東某湖泊湖區4個不同點位表層水樣，測定結果見表3。該湖區采集的樣品中檢測到微量的MCLR、MCLF、MCRR、NOD等種類藍藻毒素，其中2個樣品檢出的MCLF濃度分別為0024和0091 μg/L，檢出的MCLR濃度分別為0260和0066 μg/L，低于世界衛生組織[19]和我國地表水環境質量標準[20]中規定的限值。另有1個樣品檢出的MCRR和NOD濃度分別為0052和0040 μg/L，均處于較低濃度水平。

4結 論

本研究建立了固相萃取高效液相色譜二極管陣列檢測器法同時測定湖水中10種藍藻毒素的方法。利用二極管陣列檢測器全掃描光譜定性和色譜峰純度分析等多重定性方法，很大程度解決了結果假陽性問題，定性更可靠。該方法操作簡單、靈敏度高、快速方便，具有良好的精密度、準確度，可作為常規檢測和應急檢測方法用于地表水中10種藍藻毒素的檢測，對于液相色譜測定藍藻毒素技術的推廣應用具有重要參考價值，也為基質相對復雜的樣品中痕量藍藻毒素的測定提供了較為可靠的方法。

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AbstractA method has been developed by solid phase extractionhigh performance liquid chromatography coupled with photodiode array detector for simultaneous determination of 10 kinds of cyanotoxins in lake water， including microcystinRR （MCRR）， MCYR， MCHtyR， MCLR， MCWR， MCLA， MCLY， MCLW， MCLF and nodularin （NOD） The samples were enriched and purified by a HLB solid phase extraction column The separation was performed on a Waters C18 column （250 mm×46 mm， 5 μm） with the gradient elution of acetonitrile and water containing 005% trifluoroacetic acid The flow rate of the mobile phase was 08 mL/min The column temperature was 30℃ and the injection volume was 20 μL The photodiode array detector was scanned from 190 nm to 300 nm and the detection wavelength was 238 nm Multiple qualitative analyses were completed according to retention time， full scanning spectrum of photodiode array detector and purity analysis of chromatographic peak Good linearity was observed in the cyanotoxin concentration range of 005 mg/L-20 mg/L with correlation coefficients （R） from 09998 to 09999 The limits of detection for 10 cyanotoxins were in the range of 0005 μg/L-0020 μg/L The recoveries were in the range of 851%-1053% at the three spiked levels of 01 mg/L， 10 mg/L and 18 mg/L with the relative standard deviations （RSD） of 08%-92% The method was characterized by wide applicability， convenient operation， quick analytical rate， high sensitivity， good accuracy and high recovery The qualitative accuracy was improved by using multiple qualitative analyses This method was successfully applied to determination of 10 kinds of cyanotoxins in lake water

KeywordsHigh performance liquid chromatography； Photodiode array detector； Solid phase extraction； Cyanotoxins； Waterendprint