超高效液相色譜—串聯質譜法快速測定大鼠血清中種神經遞質

趙芳+李強+梁梅麗+閆艷+邢婕+秦雪梅+高曉霞??

摘要建立了同時測定8種神經遞質（5HT、GABA、Glu、ACH、NE、DA、5HIAA和HVA）的超高效液相色譜三重四極桿質譜方法（UHPLCMS/MS），并用于大鼠血清樣品的測定。大鼠血清經含01% 甲酸乙腈沉淀蛋白處理后，選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×21 mm，17 μm），以01% 甲酸乙腈為流動相梯度洗脫進行分離； 采用電噴霧離子源（ESI），在正離子掃描下，采用多反應監測模式（MRM）對8種神經遞質及內標化合物進行檢測。結果表明，8種神經遞質可在10 min內準確測定； 定量限為18 ng/mL，且線性良好，相關系數均大于0994，日內、日間精密度（n=6）≤92 %，穩定性、加標回收率和基質效應等均符合分析要求。本方法分析時間短、準確度好、靈敏度高、專屬性強、穩定性好、基質效應小，適用于血清中3類（單胺類、氨基酸類和乙酰膽堿）共8種神經遞質的同時定量檢測。

關鍵詞超高效液相色譜串聯質譜； 神經遞質； 血清； 含量測定

1引 言

神經遞質是在神經化學傳遞中充當“信使”的特定化學物質。腦內神經遞質分為4 類，即單胺類、氨基酸類、肽類和其它類[1]。隨著神經生物學及醫學的發展，越來越多的具有神經活性的遞質被發現，且參與人類多種疾病，尤其與精神類疾病，如抑郁癥、焦慮癥、阿爾滋海默病和記憶障礙等密切相關。神經遞質種類多，在人體內發揮作用通常并不是由某一類遞質含量單獨變化引起的。但是，神經遞質在生物樣品中含量低，且生物樣品基質復雜，內源性成分干擾較大，是生物醫學分析的難點問題。

目前，測定神經遞質方法主要有高效液相色譜聯用紫外、電化學、熒光或質譜檢測法[2～4]。然而電化學檢測因為電極易受污染而重現性不佳[5]； 紫外檢測器與熒光檢測器對神經遞質響應信號弱，均需要柱前或柱后衍生化[6]，處理步驟繁瑣，程度難以控制。因此高效簡便的前處理方法及高靈敏度的檢測手段是研究神經遞質在體內濃度變化的關鍵。質譜檢測因其選擇性強、靈敏度高、樣品前處理步驟簡單等優勢成為重要的有效檢測手段。已有的高效液相色譜質譜測定神經遞質及其相關代謝物多應用于腦勻漿或腦微透析液中[7～9]，血清中多側重于其中某一類神經遞質的測定，例如只針對氨基酸類遞質的測定[10]或只針對單胺類神經遞質的研究[11]。針對以上情況，本研究在《中國藥典》（2015年版）生物樣品定量分析方法驗證指導原則（9012）的指導下，利用UHPLCMS/MS建立了同時對血清中單胺類、氨基酸類和乙酰膽堿共8種神經遞質的快速定量方法。本方法前處理簡單快速，采用內標法定量，專屬性強。實驗結果表明，本方法靈敏度高、選擇性好、重現性好， 適合批量樣本分析。

2實驗部分

21儀器和試劑

1290Ⅱ超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）； 3200 QTRAP 三重四極桿串聯質譜儀（美國AB Sciex公司）； ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 （100 mm×21 mm， 17 μm， 美國Waters公司）； Neofuge 13R高速冷凍離心機（力康公司）； MXS可調式混勻儀（美國Scilogex公司）。

對照品： 5羥色胺（5HT，批號AWEHLMD，日本TCI有限公司）； γ氨基丁酸（GABA，批號23122，中國阿拉丁公司）； 谷氨酸（Glu，批號B326BA1039）和乙酰膽堿（ACH，批號B326BA2755）均購自生工生物公司； 去甲腎上腺素（NE，批號Z558VXU3，中國食品藥品檢定研究院）； 多巴胺（DA，批號S05J6G2）、5羥基吲哚乙酸（5HIAA，批號ERMPOBK）和高香草酸（HVA，批號S07J6G1）均購自博飛美科公司； 內標3，4二羥基苯甲酸（DHBA，批號MKBS7646V，美國SigmaAldrich公司）。甲醇、乙腈和甲酸（色譜純，Thermo Fisher公司）。 實驗用水為超純水（MilliQ純水機，美國Millipore公司）。

22實驗方法

221色譜條件流動相： 01%甲酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脫程序： 0～25 min，5% B，25～4 min，5%～20% B； 4～7 min，20%～60% B； 7～75 min，60%～5% B； 75～10 min， 5%B。流速： 02 mL/min。柱溫： 30℃。進樣量： 3 μL。

222質譜條件電噴霧離子源（ESI）： 正離子模式； 多反應監測模式（MRM）氣簾氣： 400 psi； 碰撞氣體： N2； 噴霧電壓： 5500 V； 離子源溫度： 500℃； GS1： 50 psi，GS2： 50 psi； 氣體流速： 12 L/min。質譜測定母離子、子離子與儀器參數見表1。

223標準溶液和QC溶液的配制（1） 標準品儲備液配制分別稱取5HT、GABA、Glu、ACH、NE、DA、5HIAA和HVA對照品約50 mg，各加入溶劑（02%甲酸甲醇， 8∶2，V/V）溶解，并分別定容至5 mL，制得標準品儲備液。（2）混合標準溶液配制分別精密量取標準儲備液適量，置同一容量瓶中，混勻，加溶劑（02%甲酸甲醇，8∶2， V/V）定容，制得濃度分別為90、45、18、09、045、018和009 μg/mL的5HT和NE，450、225、1125、45、225、90和45 μg/mL的GABA，450、225、1125、45、225、090和045 μg/mL的Glu，24、12、048、024、012、0048和0024 μg/mL的DA， 09、045、018、009、0045、0018、0009 μg/mL的5HIAA、ACH和HVA的混合標準系列溶液，4℃保存備用。（3）質量控制（QC）液配制同法稀釋配制低、中、高3種不同濃度的溶液，用于配制QC溶液。溶液濃度分別如下： 5HT和NE 72、09和018 μg/mL； GABA 360、45和1125 μg/mL； Glu 36、45和1125 μg/mL； DA 192、024和0048 μg/mL； 5HIAA、ACH和HVA 072、009和0018 μg/mL，4℃保存備用。endprint

224內標溶液的制備稱取DHBA對照品約50 mg，加入溶劑（02%甲酸甲醇， 8∶2，V/V）溶解并定容至5 mL，得到濃度約為10 mg/mL內標儲備液。精密量取適量內標儲備液，加溶劑定容至100 mL，制得濃度為36 μg/mL的DHBA內標標準溶液，4℃保存備用。

225動物分組、血清樣品采集與預處理SD大鼠24只，隨機平均分為3組（K，CY，CM），每組8只。其中CY組灌胃給予陽性藥鹽酸文拉法辛（35 mg/kg），其它兩組灌胃給予空白溶媒，連續給藥21天； CY組和CM組自給藥第一天開始參照本課題組前期CUMS造模方法連續造模21天[12]，K組不予造模。在21天實驗完成時采用腹主動脈取血的方式采集血液，置于EP管中，靜置30 min，4℃下3500 r/min離心10 min，分離血清，于

Symbolm@@ 80℃保存備用。 實驗時，大鼠血清樣本經室溫緩慢解凍。準確量取大鼠血清100 μL， 置15 mL EP管中， 加入內標20 μL， 02%甲酸甲醇（8∶2，V/V）溶液20 μL， 01%（V/V）甲酸乙腈200 μL， 渦旋5 min混勻， 4℃下13000 r/min 離心10 min， 取上清液置于進樣小瓶中，待測。

3結果與討論

31神經遞質的選擇

神經遞質種類多樣，與人類多種精神類疾病相關。本研究以抑郁癥動物模型為例，測定了單胺類、氨基酸類和乙酰膽堿3類神經遞質，考察得出其含量變化與中樞神經系統（CNS）疾病均有密切關系。單胺類神經遞主要有5HT、NE、DA等，具有廣泛的生物學活性，參與許多CNS的生理反應。神經突觸間隙單胺類遞質濃度水平減少被認為與抑郁癥的發病有關，抑郁癥自殺患者腦內5HT與其代謝物5HIAA含量均有所下降[13]。研究表明，神經中樞系統中5HT還與阿爾茲海默病等神經系統疾病有密切的聯系[14，15]。神經突觸釋放5HT減少是導致CNS發病的主要因素之一。NE是主要來自腎上腺髓質的一種神經遞質，其分泌受交感神經調節，研究發現， 腦中樞神經系統NE含量不足也會導致抑郁癥，反之則發生躁狂癥[16]。DA與某些神經系統功能障礙導致的疾病密切相關，如帕金森病和抑郁癥等[17，18]。Randrup于1975年首先提出，DA含量降低可能與抑郁癥的發病相關[19]，且代謝產物HVA含量也會下降[20]。影響中樞神經系統的氨基酸類神經遞質主要為Glu和GABA。Glu是學習和記憶必需的一種興奮性型神經遞質，但在高濃度下可能產生有害影響。研究表明，慢性應激刺激后谷氨酸大量釋放，進而產生神經元損害[21]。GABA是腦內主要的抑制性神經遞質，可以通過抑制性神經元突觸前末梢釋放而產生抑制效應。當GABA缺乏時常可誘發癲癇發作，提高GABA的濃度可以起到抗癲癇作用[22]。ACH是多重神經系統學習和記憶過程的重要神經遞質，人體缺少ACH則會加速腦細胞的衰老，使記憶力顯著下降，甚至導致老年癡呆[23]。壓力狀態下，腦內乙酰膽堿能神經元功能亢進，導致HPA軸功能亢進，最終還可以導致抑郁癥的發生[24]。上述8種神經遞質在人身體各組織系統中發揮著廣泛的調節作用，其含量變化與人類多種CNS疾病密切相關[25～27]。因此，檢測生物樣品中這些物質的濃度變化對于CNS相關疾病的診斷及治療有重要意義。

32色譜條件優化

由于待測物種類比較多且含酸性堿性等不同類型化合物，因此考察了對照品溶劑及其不同酸度，分別用189%甲酸甲醇（7∶3， V/V）和02%甲酸甲醇（8∶2， V/V）溶解對照品并進樣，以待測物的分離度、靈敏度及選擇性為參考基準，發現前者有待測物出現雙峰，而后者待測物出峰均符合要求。

分別考察了乙腈和甲醇的流動相體系，發現乙腈作為流動相時出峰更平滑，峰形更好。考慮到待測物的化學性質，對流動相中堿性（氨水）、酸性（01%甲酸、02%甲酸）及緩沖鹽體系（乙酸乙酸銨， pH=35； 10 mmol/L乙酸銨）等添加劑的種類與濃度進行考察，綜合比較發現01%甲酸分析效果最佳。最終確定01%（V/V）甲酸為流動相A、乙腈為流動相B，優化后的梯度條件為： 0～25 min， 5% B； 25～40 min， 5%～20% B； 4～7 min， 20%～60% B； 7～75 min， 60%～5% B； 75～10 min， 5%B。 圖1為空白血清和血清中加入低濃度標準的8種神經遞質的色譜圖。

33血清樣本預處理方法的優化

本研究中測定的化合物極性較大，因此重點考察不同溶劑沉淀蛋白的效果。對沉淀蛋白的有機試劑甲醇和乙腈進行考察，結果顯示經乙腈沉淀蛋白后待測物的峰形更平滑，背景基質干擾更小。實驗中還發現在乙腈中加入甲酸可以改善目標化合物的峰形，且01%甲酸乙腈（V/V）為最佳。推測可能由于待測化合物的化學結構均含酸性或堿性基團的原因。

34方法學考察

由于待測化合物屬于大鼠血清樣本中內源性物質，為了降低基質效應對測定結果的影響，本研究依據《中國藥典2015年版生物樣品定量分析方法驗證指導原則（9012）》，采用血清基質添加標準品的方法進行方法學驗證，考察了標準曲線與線性范圍、精密度與準確度、提取回收與基質效應和穩定性。

341標準曲線及線性范圍取離心機管數支，分別加入已知濃度的大鼠血清100 μL、20 μL的內標溶液（36 μg/mL）和20 μL的標準系列液，渦旋混勻。按照“血清樣品預處理”項下方法操作。以待測物峰面積（As）與內標物峰面積（Ai）的比值與空白血清樣品中待測物峰面積（A0）與內標物峰面積（A0i）比值的差值為縱坐標（y=As/Ai–A0/A0i）、以血清中加入的待測物標準品濃度（μg/mL）為橫坐標（x），用加權最小二乘法進行回歸計算，權重系數為 1/x2，得到8種神經遞質的回歸曲線方程。 LOQ是標準曲線上最低濃度點，信噪比（S/N）>10。結果見表2。endprint

342準確度和精密度取空白血清100 μL，分別加入20 μL內標溶液和20 μL高、中、低3個濃度的QC溶液，配制成高、中、低3個濃度水平的樣品，按照225方法進行預處理。每個濃度進行6個樣本分析，并且連續進樣3天，根據當天的標準曲線計算高、中、低3個濃度水平樣品的濃度，求算本方法的精密度RSD（%）和準確度RE（%），結果見表3。

343基質效應與提取回收率取空白血清100 μL，分別加入20 μL內標和20 μL高、中、低3個濃度的QC溶液，按照225節預處理，測得的待測物峰面積為A1； 另取空白大鼠血清100 μL，先按照225節預處理，加入20 μL內標和20 μL高、中、低3個濃度的QC溶液，混勻測得的待測物峰面積為A2； 取空白溶劑100 μL，分別加入20 μL內標和20 μL高、中、低3個濃度的QC溶液，按照225節預處理，測得的待測物峰面積為A3，每個濃度樣品分別平行制備3份。提取回收率= A1/A2×100%； 基質效應= A2/A3×100%。結果見表3。

35樣品分析

采用本方法對SD大鼠血清進行測定，結果如表5所示，與空白對照組相比，模型組5HT和NE含量顯著降低，GABA和5HIAA的含量顯著升高，與文獻[11，28～30]報道的研究結果一致。Glu、DA、Ach和HVA雖也具有升高趨勢（3%～10%），但未顯示顯著差異。經文拉法辛給藥后，5HT、GABA和5HIAA顯著回調； NE和Glu有回調趨勢，與文拉法辛的抗5HT與NE的再攝取抑制作用機制一致。

4結 論

本研究建立了同時對大鼠血清中單胺類、氨基酸類和乙酰膽堿共8種神經遞質的UPLCMS/MS快速定量分析方法，優化了血清樣品制備方法，減少了前處理步驟繁瑣帶來的較多誤差，分析更加快速簡便。 本方法線性關系較好、靈敏度高、穩定性好，提取回收率與基質效應均符合相關要求。本方法不僅可用于抑郁癥血清樣品中神經遞質水平的測定，而且可用于CNS相關疾病樣品的測定與診斷。

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AbstractAn ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometric （LCMS/MS） method for simultaneous determination of 8 kinds of neurotransmitters （5HT， GABA， Glu， ACH， NE， DA， 5HIAA， HVA） in rat serum was developed The blood samples were extracted by 01% formic acid in acetonitrile and separated on a Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （21 mm×100 mm， 17 μm） using gradient elution， with the mobile phase consisting of acetonitrile and 01% formic acid in water The samples were then ionized with positive electrospray （ESI+）， and detected under multiple reaction monitoring （MRM） mode As a result， 8 kinds of neurotransmitters were determined accurately in 10 min with a limit of quantitation of 18 ng/mL and intraday and interday precisions of ≤92% （n=6） This method showed a good linearity in detection of neurotransmitters and the linear correlation coefficients were greater than 0994 Also the stability， recovery and matrix effect were eligible for the analysis This method showed high accuracy， sensitivity， strong specificity， good stability， small matrix effect and short time for analysis， and was suitable for the quantitative determination of monoamine， amino acids and acetylcholine neurotransmittes in rat serum

KeywordsUltrahigh performance liquid chromatographtandem mass spectrometry； Neurotransmitters； Serum； Determinationendprint