激酶檢測方法的最新研究進展

劉楊+鄒笑然+李琛琛+張春陽

摘要激酶是生物體內一類重要的磷酸轉移酶，能夠催化磷酸基團由高能磷酸基團供體分子（如AP）向特定底物分子轉移。激酶不但在新陳代謝、細胞信號傳導、蛋白質調控、細胞傳輸等過程中起著關鍵作用，而且在臨床診斷、藥物研發及疾病靶向治療等方面也發揮著重要作用。因此，發展靈敏度高、特異性好的激酶檢測方法十分必要。本文以蛋白激酶A（Protein kinase A， PKA）、酪蛋白激酶（Casein kinase2， CKII）、多核苷酸激酶（ polynucleotide kinase， PNK）為例，對近年來發展的激酶檢測方法進行了綜述，著重介紹了熒光分析法、單分子檢測、比色法、化學發光和生物發光分析法、電化學和光電化學分析法，并對激酶檢測方法的發展方向進行了展望。

關鍵詞激酶； 靈敏檢測； 分析方法； 評述

1引 言

激酶（Kinase）是生物體內一類催化磷酸基團由高能磷酸基團供體分子（如AP）向特定底物分子轉移的酶，其催化的磷酸基團轉移過程亦稱磷酸化。激酶的作用底物包括蛋白質、脂質、碳水化合物、核苷酸等。根據作用底物的不同，可分為蛋白激酶、脂質激酶、碳水化合物激酶等。激酶廣泛參與新陳代謝、細胞信號傳導、蛋白質調控、細胞傳輸等重要細胞過程，對維持生物體正常的生理功能十分重要。激酶的突變將導致激酶功能紊亂，激酶功能的失調與許多疾病的發生發展密切相關[1，2]。由于激酶在細胞中起著信號調節作用，激酶亦是重要的藥物靶標[3]。

在種類眾多的激酶中，蛋白激酶（Protein kinase）是最大的一類激酶族群。人類基因組中存在518種蛋白激酶基因， 約占其總量的2%[，5]。蛋白激酶能夠將磷酸基團從核苷三磷酸（通常是腺苷5'三磷酸，AP）轉移到底物蛋白特定的氨基酸殘基上，催化蛋白質的磷酸化反應。根據其底物蛋白被磷酸化的氨基酸殘基種類不同，蛋白激酶可分為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、組氨酸蛋白激酶、色氨酸蛋白激酶、天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶五類。蛋白激酶通過調節底物蛋白的活性、相互作用[6，7]及穩定構象，間接調節細胞功能（如細胞循環、細胞凋亡、代謝和蛋白合成）[8]，并在細胞信號轉導通路[9]、免疫應答[10]、細胞周期調節[11]和能量平衡[12]等過程中起關鍵作用。蛋白激酶的突變和活性的失調可導致一系列疾病的發生，如癌癥[11]、糖尿病并發癥[13]、神經病癥和神經變性疾病[1]以及心臟功能障礙[15]等。蛋白激酶已成為疾病的藥物治療靶標[16，17]，美國食品藥品監督局（DA）已批準多種蛋白激酶抑制劑用于癌癥治療[18]。

多核苷酸激酶（Polynucleotide kinase，PNK）也是一種具有重要生理功能的激酶，廣泛存在于真核細胞和原核細胞中。PNK同時具有5'激酶和3'磷酸酶活性，可以催化DNA或RNA分子末端，將5'O/3'PO轉化成5'PO/3'O[19]。通過催化5'羥基末端的磷酸化，PNK在許多細胞活動（如DNA重組[20]和DNA/RNA修復[21]）中起著至關重要的作用。研究表明，PNK的突變能導致多種疾病的發生，如小頭癥和癲癇[22]、Werner綜合征、Bloom綜合征和Rothmundhomson綜合征等[23]。

激酶廣泛參與生物體內多種細胞過程，在復雜的生命活動中起著至關重要的作用。因而發展靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本低的激酶活性檢測方法，在激酶功能研究、臨床診斷、藥物篩選以及疾病靶向治療等方面都具有重要意義。激酶活性檢測的常規方法包括放射性同位素標記法、放射自顯影像法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法[19，2～26]。但是這些方法存在放射性污染、檢測耗時、操作繁瑣、不適用于大規模篩選等缺點。因此，迫切需要發展簡單、快速、超靈敏且環境友好的激酶檢測方法。近年來，非放射性檢測方法如熒光分析法、比色法、電化學分析法、化學發光和生物發光分析法等蓬勃發展，在激酶檢測研究中顯示出獨特的優勢[27]。本文主要以蛋白激酶A（Protein kinase A， PKA）、酪蛋白激酶（Casein kinase2，CKII）、多核苷酸激酶（ polynucleotide kinase， PNK）為例，結合本課題組的工作，綜述近年激酶活性檢測方法的研究進展。PKA又稱為依賴于cAMP的蛋白激酶A （CyclicAMP dependent protein kinase A），是目前研究最廣泛的蛋白激酶，常作為激酶活性檢測的模型[28，29]； CKII是一種普遍參與細胞生長、增殖、凋亡等重要生理過程[30]的蛋白激酶，其異常表達與多種疾病密切相關； PNK是一種由噬菌體的pse基因編碼的激酶，常作為多聚核苷酸激酶的模型被廣泛研究，同時也是核酸探針標記和基因工程中重要的工具酶[31，32]。

2激酶的檢測方法

21熒光分析法

與傳統的分析方法相比，熒光分析法具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、適用于高通量分析等優點。近年來，熒光分析法與新型納米材料、等溫擴增技術相結合，廣泛應用于激酶檢測的研究。石墨烯氧化物（GO）是一種單分子層厚度的二維（2D）碳納米材料，能有效猝滅熒光基團的發光。GO具有可控的表面吸附性質，是構造生物傳感器的最佳選擇[33]。Lin等[3]將GO和λ核酸外切酶相結合，對多核苷酸激酶（ PNK）的活性和抑制作用進行分析，檢出限為005 U/mL。該方法無需復雜的探針設計，具有操作簡單的優點。Sun等[35]將GO與核酸外切酶III（Exo III）和連接酶介導的循環反應相結合，實現了熒光信號的猝滅和放大，將 PNK的檢出限降低至0003 U/mL。該方法無需設計特定的酶識別序列，靈敏度高。hou等[36]構造了一種新型GO肽納米傳感器，可定量檢測蛋白激酶。發生磷酸化的肽鏈會抑制羧肽酶Y（CPY）的降解，導致染料標記的肽鏈吸附到GO表面，熒光信號被猝滅； 而未發生磷酸化的肽鏈被CPY降解，熒光信號不受GO影響。該方法已成功應用于檢測CKII和PKA，檢出限分別為00833和0130 mU/μL。該方法具有操作簡單、穩定、靈敏度高等優點，可同時進行熒光各向異性分析。endprint

除石墨烯氧化物外，一系列新型納米材料也廣泛應用于構建激酶的熒光分析體系。Li等[37]設計了一種發夾結構探針修飾的多功能磁性納米微球，結合聚合切口反應介導的超支化滾環擴增（RCA），對 PNK活性進行靈敏檢測，檢出限可達0036 mU/mL。 該方法可用于定量分析細胞提取物中 PNK活性。Qing等[38]利用啞鈴狀DNA模板合成銅納米粒子，應用于 PNK和連接酶活性的檢測。該方法無需熒光標記，對 PNK檢出限為005 U/mL。 Cen等[39]利用羥基氧化物CoOO納米片作為探針，結合λ核酸外切酶裂解反應檢測 PNK活性，檢出限可達001 U/mL。Liu等[0]利用稀土摻雜的上轉換熒光納米粉（UCNPs）構建了發光能量共振轉移（LRE）體系，用于蛋白激酶PKA分析（圖1）。在該體系中，稀土摻雜的上轉換熒光納米粉NaY：Yb，Er作為LRE供體以及磷酸化肽鏈的識別基質，四甲基羅丹明（AMRA）標記的底物肽鏈作為LRE受體。染料標記的底物肽鏈被PKA磷酸化后，能被UCNPs中的稀土離子特異性捕獲，實現AMRA與UCNPs之間的LRE過程，產生熒光信號。該方法無需添加額外的識別分子，操作步驟簡單。由于UCNPs允許多個低頻光子的激發，因而能夠避免自發熒光和光散射等背景干擾，信噪比好，靈敏度高，檢出限可達5×10Symbolm@@ 5 U/μL。

基于主客體相互作用對熒光染料分子的保護，環糊精及其聚合物能顯著增強熒光分子的發光效應[1]，可用于構建激酶的熒光檢測系統。Song等[2]發展了基于β環糊精聚合物（polyβCD）和λ核酸外切酶反應的 PNK活性分析方法。polyβCD能使染料分子的熒光信號增強10倍以上，顯著提高激酶檢測的靈敏度，檢出限可達002 U/mL。該方法避免了DNA探針的雙標記和復雜設計，可用于復雜樣品分析。Xu等[3]利用芘作為熒光探針，利用γ環糊精結合DNA托鏈位移反應（SDR）實現兩次熒光信號放大，顯著提高 PNK檢測的靈敏度，檢出限達93×10Symbolm@@ 5 U/mL。

最近，hang等[]開發了一種λ核酸外切酶輔助的紙基熒光分析法，可用于PNK活性的檢測。該方法通過分析醛基改性紙張表面Cy5熒光強度的變化檢測PNK活性，檢出限為00001 U/mL。Cheng 等[5]將DNA鏈置換反應與酶輔助擴增相結合，用于檢測 PNK活性。該方法無需進行熒光標記，靈敏度高，檢出限可達66×10Symbolm@@ U/mL。hang等[6]發展了一種流式細胞術磁珠測定法（CBA），用于超靈敏檢測 PNK活性。該方法利用雜交鏈反應（CR）擴增技術對磁珠表面的熒光信號進行放大，同時利用流式細胞術讀取磁珠表面的熒光信號，檢出限可達×10Symbolm@@ 6 U/mL。該方法靈敏度高，特異性好，適用于復雜生物基質的檢測。

22單分子檢測

單分子檢測技術能夠在單分子水平上對目標分子進行超靈敏檢測，具有靈敏度高、信噪比好、檢測樣本需求量少等優點，在生化分析領域得到廣泛應用。Wang等[7]構建了基于單個量子點（QD）的納米傳感器，可對蛋白激酶PKA進行超靈敏檢測（圖2）。當PKA和磷酰基供體γ生物素AP存在時，Cy5標記的底物肽鏈可同時實現磷酸化和生物素化，并自組裝到修飾有鏈霉親和素的QD表面，形成Cy5肽QD夾心納米結構，實現QD和Cy5之間的RE。通過全內反射熒光（IR）顯微鏡可對RE信號進行準確測量，用于PKA定量分析。該方法操作簡便，無需洗滌和分離步驟，靈敏度高，檢出限為93×10Symbolm@@ 6 U/μL。該方法還可用于篩選PKA抑制劑和激活劑。

本課題組[8]利用金納米粒子（AuNP）對熒光信號的猝滅及磷酸化誘導的熒光信號恢復，結合λ核酸外切酶介導的裂解反應，在單分子水平上對PNK進行檢測（圖3）。當 PNK存在時，發夾探5'羥基末端磷酸化，隨后在λ核酸外切酶作用下，發夾探針展開并暴露結合探針序列。結合探針與Cy5捕獲探針AuNP納米復合體中的捕獲探針雜交，形成雙鏈DNA（dsDNA）。該dsDNA能被λ核酸外切酶裂解，釋放出Cy5分子和結合探針。釋放的結合探針能與新的Cy5捕獲探針AuNP納米復合體中的捕獲探針雜交，引發新一輪的雜交裂解釋放，最終釋放出大量Cy5分子。基于IR的單分子熒光檢測方法能對Cy5分子進行熒光成像，用于 PNK定量分析，檢出限為977×10Symbolm@@ 8 U/μL。該方法可以定量檢測癌細胞提取物中的 PNK，并可用于篩選 PNK抑制劑。 該方法靈敏度高、通用性強，通過設計合適的DNA底物和選擇合適的熒光基團，可實現多種核苷酸激酶的同時檢測。

23比色法

比色法是通過比較或測量有色溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。該方法具有操作簡單、成本低、直觀可見等優點[9]。將納米材料和生物酶催化反應引入比色分析，極大的拓展了比色法的應用范圍，為激酶的檢測開辟了新途徑。歐麗娟等[50]建立了一種基于納米金凝聚變色效應的比色方法，用于檢測 PNK活性。無 PNK時，由于靜電效應和空間位阻效應，發卡探針修飾的金納米顆粒能夠穩定存在溶液中，溶液顏色為納米金單分散狀態時的紅色。當 PNK存在時，發卡探針發生5'羥基磷酸化，隨后λ核酸外切酶將發卡探針從金納米顆粒切除，導致納米金顆粒因無DNA鏈保護而發生聚集，溶液變為藍紫色。該方法簡單直觀，儀器依賴程度低，檢出限為02 U/mL。Liu等[51]發展了一種基于G四鏈體/氯高鐵血紅素DNA酶的免標記比色法，用于檢測 PNK活性。他們設計了3'端G堿基富集的發夾探針以及和發夾探針部分互補的3'磷酸引物DNA。 PNK能將3'磷酸引物DNA催化為3'羥基引物DNA，并引發引物DNA的延長反應，導致發夾探針展開和G四鏈體形成。G四鏈體可以和溶液中的氯高鐵血紅素結合形成G四鏈體/氯高鐵血紅素DNA酶，催化2O2氧化2，2'聯氮雙（3乙基苯并噻唑啉）6磺酸（ABS2endprint

Symbolm@@ ）反應，導致溶液顏色變化。該方法無需復雜標記，靈敏度高，檢測極限為001U/mL。該方法還可用于 PNK抑制劑的篩選。

2化學發光分析法

化學發光分析法通過測量化學發光反應中發光物質由激發態躍遷回基態時發出的光信號，實現對目標分子的檢測[52]。化學發光分析法無需額外光源，具有靈敏度高、信號收集迅速以及易于實現自動化等優點[53]。化學發光分析與其它技術聯用極大拓展了其應用范圍。將擴增技術引入化學發光分析，能夠顯著提高激酶檢測的靈敏度和特異性。ang等[5] 發展了一種基于滾環擴增（RCA）誘導的化學發光分析法，用于超靈敏檢測PNK活性（圖）。 PNK催化單鏈DNA底物發生磷酸化反應，隨后與掛鎖探針雜交，在DNA連接酶作用下形成一個封閉的環狀DNA。環狀DNA和掛鎖DNA可分別作為RCA反應的模板和引物，生成具有DNA酶功能的單鏈DNA，并在氯高鐵血紅素分子協助下折疊成G四鏈體結構，催化魯米諾2O2反應，產生化學發光信號。該方法利用RCA的高效擴增和DNA酶誘導的化學發光信號增強，可超靈敏檢測 PNK活性，檢出限達220×10Symbolm@@ U/mL。該方法可用于篩選 PNK抑制劑和激活劑，并可應用于實際樣品分析。

Li等[55]將功能化磁性微粒（MMPS）和催化發夾組裝（CA）反應相結合，構建了一種靈敏的DNA walker生物傳感器，可用于 PNK活性檢測。他們通過CA反應將生物素標記的發夾DNA組裝到MMPS表面，隨后利用鏈霉親和素生物素相互作用將辣根過氧化物酶組裝到DNA walker傳感器，催化化學發光體系產生信號。該方法靈敏度較高，特異性好，檢出限為0003 U/mL。

除了化學發光分析法，電致化學發光（ECL）也廣泛應用于激酶的超靈敏檢測。ECL分析法通過檢測電化學反應產生的化學發光信號對目標分子進行分析。ECL方法具有高靈敏度、低背景、檢測裝置簡單、反應時間和空間可控等優點[56～60]。聯吡啶釕絡合物及其衍生物是最常用的電致化學發光劑。Dong等 [61]發展了基于聯吡啶釕絡合物[Ru（bpy）3]2+功能化金納米粒子 （[Ru（bpy）3]2+AuNPs）的電致化學發光生物傳感器，用于檢測蛋白質激酶CKII和PKA活性。在蛋白激酶和5'硫代三磷酸腺苷（APs）存在時，自組裝到金電極上的底物肽能夠特異性地發生硫代磷酸化反應。通過靜電作用結合的[Ru（bpy）3]2+AuNPs復合體可與肽鏈中的硫代磷酸基團通過AuS鍵連接，自組裝到金電極的表面，并在共反應物三丙胺的作用下產生ECL信號。該方法靈敏度高，特異性好，對CKII和PKA的檢出限分別為0008和0005 U/mL。該方法可應用于檢測血清樣本中CKII活性，也可用于CKII和PKA抑制劑的篩選。Liu等[62]利用釕衍生物標記的蛋白作為ECL探針，用于檢測蛋白激酶PKA和CKII活性。蛋白激酶可將組裝到金電極表面的底物肽鏈中的絲氨酸磷酸化，單克隆磷酸化絲氨酸抗體能夠識別并結合肽鏈中磷酸化的絲氨酸，同時釕衍生物標記的蛋白A（ECL探針）可特異性與磷酸化絲氨酸抗體結合，因而ECL探針可組裝到金電極表面實現ECL。該方法非常靈敏，對PKA和CKII的檢出限分別為0005和000 U/mL。 他們進一步發展了ECL成像，實現了001～00 U/mL范圍內PKA和CKII的同時檢測。該方法還可以用于激酶抑制劑的篩選和細胞中蛋白激酶活性的檢測。

25生物發光分析法

本課題組[63]發展了一種通過實時檢測磷酸化依賴的DNA連接反應實現 PNK活性檢測的生物發光分析法（圖5）。在該方法中，兩個具有5'突出末端的發夾DNA探針作為磷酸基團受體，dCP作為磷酸基團供體。在無 PNK存在時，發夾DNA探針中缺少5'磷酰基，不能觸發DNA連接反應，無生物發光信號產生。當 PNK存在時，兩個發夾DNA探針發生5'端磷酸化，在DNA連接酶作用下發生DNA連接反應，釋放出AMP，其向AP轉化過程中產生生物發光信號。通過監測生物發光信號，可實現 PNK活性的實時分析，檢出限為000 U/mL。該方法無需標記，無需外部光激發，無自發熒光干擾，操作簡單，可應用于PNK的定量分析、動力學分析以及抑制劑的篩選。

26電化學分析法

電化學分析法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡單和成本低等優點[6]，在激酶檢測中具有廣泛應用。Yin等[65]利用肽鏈磷酸化對羧肽酶Y（CPY）活性具有抑制作用的原理，發展了可對蛋白激酶CKII活性進行靈敏檢測的電化學分析法。在CKII存在時，自組裝在金電極表面的CKII底物肽鏈發生絲氨酸位點磷酸化，該位點的磷酸化可抑制CPY對底物肽鏈的消化，保持肽鏈和氧化還原探針e（CN）3 Symbolm@@ 6之間的排斥力，產生微弱的電化學信號。當無CKII存在時，CPY將底物肽鏈完全水解為氨基酸，導致排斥力消失，產生強電化學信號。通過監測電化學信號可實現蛋白激酶的活性分析。該方法靈敏度高，檢出限為007 U/mL，能在復雜體系中對CKII進行活性分析。

最近，微芯片和新型納米復合材料的引入極大豐富了激酶的電化學分析方法。Chand等[66]構造了一種EIS傳感微芯片，通過檢測PKA特異性適配體修飾的EIS傳感器表面電荷的變化，實現對PKA的特異性分析，檢出限為2 U/mL。該傳感器還可與其它生物傳感器集成，用于多重分析。Liu等[67]利用納米金顆粒多壁碳納米管復合物（AuNPs/MWNs）的催化作用，發展了對蛋白激酶PKA進行超靈敏檢測的電化學分析法，檢出限為009 U/mL。hou等[68]將Au@C納米復合材料、鏈霉親和素SiO2復合物及AuNPs生物素化β半乳糖苷酶相結合，構建了可分析PKA活性的電化學生物傳感器，檢出限為001 U/mL。

27光電化學分析法endprint

光電化學（PEC）分析法是基于光活性物質的光電轉換性質檢測待測物的一種方法，通過檢測光活性物質被激發后產生的光電流，可實現對目標物質的靈敏分析。光電化學分析法具有靈敏度高、操作簡單、檢測裝置成本低等優點，在生化分析領域具有廣闊應用前景[69～75]。光電化學分析法中常用的光活性物質包括無機半導體材料（如CdS量子點和iO2納米粒子等）、有機半導體材料（聯吡啶釕衍生物和卟啉及其衍生物等）和復合半導體材料[7]。hou等[76]利用Bi2S3納米棒和AuNPs修飾的IO電極，結合生物素標記的phostag構建可靈敏檢測蛋白激酶PKA的PEC生物傳感器，檢出限達0017 U/mL。Yin等[77]利用gC3NAuNPs復合納米材料及生物素標記的phostag和堿性磷酸酶（ALP）催化的信號放大原理，構建了可對PKA靈敏檢測的信號增強型PEC生物傳感器，檢出限為0015 U/mL。最近，Li等[78]利用gC3NiO2復合納米材料、PAMAM樹狀大分子和堿性磷酸酶（ALP）引發的信號放大，構建了可進行PKA活性分析的新型PEC生物傳感器。該方法在溶液中進行磷酸化反應，有利于反應充分進行，操作步驟簡單，靈敏度高，檢出限為008 U/mL。huang等[79]利用AuNPs和gC3N納米片復合材料對電極進行修飾，結合等溫擴增技術和氯高鐵血紅素/G四鏈體DNA酶輔助的生物催化沉淀，實現了 PNK的靈敏分析。該方法中，AuNPs表面的等離子共振增強效應使PEC體系的光電流信號增大100%，等溫擴增技術和DNA酶輔助的生物催化沉淀等多種信號放大技術的聯用顯著提高了檢測靈敏度，檢出限達10 mU/mL。

最近，Wang等[80]利用金屬有機骨架化合物（MOs）構建了可超靈敏檢測蛋白激酶的PEC生物傳感器。在蛋白激酶PKA存在下，修飾于iO2/IO電極上的底物肽發生磷酸化反應。由于具有r+表面缺陷，載有PEC光活性物質[Ru（bpy）3]2+的鋯團簇金屬有機骨架材料（[Ru（bpy）3]2+@UiO66）可通過螯合作用與磷酸化的底物肽結合，使[Ru（bpy）3]2+@UiO66與iO2/IO電極相連。[Ru（bpy）3]2+在可見光照射下產生受激電子，該電子注入到iO2導帶中產生光電流信號。鋯團簇金屬有機骨架材料具有表面積大和孔隙率高的特點，能吸附大量[Ru（bpy）3]2+，顯著增強PEC體系的光電流信號，檢出限可達0009 U/mL。

3總結與展望

激酶是生物體內重要的磷酸轉移酶，通過催化底物分子的磷酸化過程廣泛參與細胞信號傳導、細胞復雜過程的調控，是重要的藥物標靶。激酶活性的靈敏檢測在疾病診斷、藥物研發和靶向治療等領域具有重要意義。由于易產生放射性廢物、操作繁瑣等問題，傳統的放射性同位素標記法、放射自顯影像法等已逐漸被非放射性分析方法所取代。在新發展的激酶分析方法中，熒光分析法應用最為廣泛，具有如下優點：（1）靈敏度高，應用范圍廣； （2）熒光團無需特殊處理，環境友好； （3）基于熒光的分析技術（例如RE和LIM）有望實現活體檢測和成像。另外，其它新發展的方法也各具特點：比色法操作簡單且成本低[81]； 化學發光分析法無需外光源，操作方便，分析快速，易實現自動化； 電化學分析法簡單快速，成本較低[82]。目前，發展簡單、快速、成本低廉、靈敏度高的激酶活性分析方法仍然是一個挑戰。值得注意的是，近幾年涌現的新技術單分子檢測法具有靈敏度高和樣品消耗量低等優點，在激酶活性分析領域具有廣闊應用前景。納米材料具有良好的光學性能和可控的表面吸附性能，為構建新型激酶生物傳感器提供了新材料。一些高效擴增技術如滾環擴增（RCA）和雜交鏈反應（CR）的引入，為發展高靈敏的激酶分析方法指引了新方向。我們堅信隨著激酶分析方法的不斷發展，激酶在藥物開發、臨床診斷以及生化分析等領域中的應用前景也將越來越廣闊。

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