噻呋酰胺人工抗原的合成及酶聯免疫吸附分析方法的建立

李瀟瀟+丁書茂+楊旭+袁均林

摘要以化合物2甲基三氟甲基5噻唑甲酸（MCA）為噻呋酰胺的半抗原合成人工抗原，采用活潑酯法合成免疫原MCABSA，分別采用活潑酯法、混合酸酐法和N，N'羰基二咪唑/二甲氨基吡啶（CDI/DMAP）法合成3種包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3。免疫動物后，最終以包被原MCAOVA3篩選并獲得了具有高特異性的噻呋酰胺多克隆抗體，建立了檢測噻呋酰胺的間接競爭酶聯免疫吸附（icELISA）分析方法。本方法線性檢測范圍為008～1000 mg/L，半數抑制濃度（IC50）為139 mg/L，檢出限為008 mg/L，對自來水、湖水和小麥中的噻呋酰胺添加回收率在720%～1283%之間，檢測結果與PLC法具有良好的相關性（R2=0999）。本研究建立的icELISA方法可用于環境水樣與小麥等農產品中噻呋酰胺殘留的快速檢測。

關鍵詞噻呋酰胺； 人工抗原； 多克隆抗體； 酶聯免疫吸附分析

1引 言

噻呋酰胺是一種用途廣泛的含氟殺菌劑，可有效防治谷物、水果、蔬菜中的多種病害，對紋枯病有特效[1]。噻呋酰胺在水稻和花生中的半衰期分別為91～16 d和91～116 d，而在土壤中的半衰期更長[2，3]。Yang等[]研究發現噻呋酰胺可引起斑馬魚的胚胎發育畸形以及肝臟和腎臟組織損傷。隨著噻呋酰胺用量的增加，消費者在日常生活中與之接觸的風險也在逐漸升高，使消費者健康受到威脅，因此其殘留情況不容忽視。我國國家標準GB 27632016[5]中規定噻呋酰胺在稻谷、糙米和馬鈴薯中的最大殘留量（MRL）分別為7、3和2 mg/kg。

現有的噻呋酰胺殘留的檢測方法包括高效液相色譜法（PLC）[6]、氣相色譜法（GC）[7]、超高效液相色譜串聯質譜法（UPLCMS/MS）[8]等，此類方法操作復雜、耗時耗力，而且依賴大型儀器和專業操作人員。建立簡單、快速、靈敏和不依賴于大型儀器的方法，對于農藥日常監管和殘留的快速篩查都具有重要的實際意義，而酶聯免疫吸附分析方法（ELISA）可以滿足上述要求[9]。

噻呋酰胺的分子結構中無活潑基團，難以直接與載體蛋白偶聯制備其抗體。Rejeb等[10]對噻呋酰胺的分子結構進行改造，使用的半抗原包含了噻呋酰胺的整個分子結構，但僅用獲得的抗體制備了噻呋酰胺免疫吸附層析柱，并未詳述半抗原的制備方法，也未建立起ELISA檢測方法。本研究嘗試以噻呋酰胺分子結構一半的化合物作為半抗原，通過不同的方法合成噻呋酰胺人工抗原，最終用獲得的高特異性抗體建立間接競爭酶聯免疫吸附分析方法（icELISA），可對環境與農產品中的噻呋酰胺殘留進行檢測。

2實驗部分

21儀器與試劑

UV2700紫外可見分光光度計（日本Shimadzu公司）； DNM9602型酶標儀（北京普朗新公司）； Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

噻呋酰胺（98%，上海將來實業有限公司）； 2甲基三氟甲基5噻唑甲酸（MCA，98%，上海書亞醫藥科技有限公司）； 氯甲酸異丁酯（98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠抗體IgG（酶標二抗，武漢亦新生物技術公司）； N， N'羰基二咪唑（CDI，99%）、二甲氨基吡啶（DMAP，99%）、環己基碳二亞胺（DCC，99%）、N羥基琥珀酰亞胺（NS，98%）購于成都西亞試劑公司； 三正丁胺（99%）、牛血清蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）、福氏完全佐劑（CA）、福氏不完全佐劑（ICA）購于Sigma公司； 底物顯色液為鄰苯二胺（OPD）顯色液（OPD mg，02 mol/L Na2PO 257 mL， 01 mol/L 檸檬酸23 mL，d2O 5 mL，30% 2O2 μL，現用現配）； 其它試劑均為國產分析純或色譜純。

22實驗方法

221人工抗原的合成采用活潑酯法[11]合成免疫原MCABSA； 采用活潑酯法[11]、混合酸酐法[12]、CDI/DMAP法[13]分別合成包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3。所有人工抗原均采用紫外吸收光譜掃描鑒定。

222動物的免疫將只周齡的雌性Balb/c小鼠用MCABSA免疫，免疫方法按文獻[1]進行。

223小鼠血清效價及靈敏度的檢測第次免疫結束后第7天，將小鼠斷尾取血，收集血清。采用間接ELISA方法檢測小鼠血清效價：將3種包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3用包被緩沖液稀釋到1 μg/mL [15]，包被酶標板，℃包被過夜。用3% 脫脂奶粉封閉，250 μL/孔，37℃孵育1 h，洗板； 加入2倍梯度稀釋的系列濃度（從1000～128000倍）的血清，100 μL/孔，37℃孵育1 h，洗板； 加入二抗（100 μL/孔），37℃孵育1 h； 加入底物顯色液（100 μL/孔），37℃避光顯色15 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L 2SO終止反應，用酶標儀測各孔OD92 nm值，以OD92 nm≈1的血清稀釋倍數為效價[16]。

采用間接競爭ELISA方法對血清進行檢測：將上述效價檢測操作中加血清這一步驟改為加入50 μL 2倍效價濃度的血清和50 μL不同濃度的噻呋酰胺標準溶液，其余各步不變。根據公式（1）計算抑制率（I）：

I （%）=[1-（ODinhitition hole/ODpositive hole）] ×100（1）

將產生目標抗體的小鼠加強免疫后收集血清，選取最適的包被原包被酶標板，建立icELISA檢測標準曲線。

22抗體特異性檢測選取與噻呋酰胺分子結構類似的含氟農藥精吡氟禾草靈、氟鈴脲、氟酰胺、三氟羧草醚，采用建立的方法測定，計算IC50值，按照公式（2）計算交叉反應率（CR）：endprint

CR（%）=（IC50（hifluzamide）/IC50（Analyte））×100（2）

225加標回收實驗在自來水、武漢東湖水和小麥中添加不同濃度的噻呋酰胺。加標水樣直接采用icELISA法或PLC法檢測。取10 g小麥粒樣品于錐形瓶中，添加噻呋酰胺后，靜置過夜。其提取步驟根據文獻[17]略有改動：用20 mL丙酮振蕩提取并抽濾，重復操作一次，將兩次丙酮提取液置于分液漏斗，加入50 mL 5% NaCl溶液，用30 mL二氯甲烷萃取兩次。將兩次二氯甲烷相合并，經無水Na2SO脫水，旋轉蒸發至近干后，用含20%甲醇的PBS定容至10 mL，待測。以PLC法 [6]測定結果為對照。

3結果與討論

31噻呋酰胺半抗原的設計

噻呋酰胺的分子結構中不含氨基、羧基、羥基等可與載體蛋白直接偶聯的活潑基團。如果在其分子中引入活潑基團，不僅操作復雜、耗時耗力，還要對重塑的半抗原進行質譜鑒定。研究發現，如果獲得了某種分子一半結構的物質的抗體，這種抗體對該分子也具有一定的識別能力，也可作為目標物抗體[18～20]。對噻呋酰胺分子而言，含有羧基的MCA是它所特有的一半的結構（圖1），因此本研究以MCA作為噻呋酰胺的半抗原與載體蛋白偶聯，過程簡便，省時有效。

32人工抗原的紫外吸收光譜鑒定

將載體蛋白與人工抗原用PBS調整到1 mg/mL后進行紫外吸收光譜掃描。如圖2所示，MCA、BSA和OVA的最大吸收峰分別在26、278和279 nm處，所有人工抗原的吸收曲線與相應的半抗原和載體蛋白相比均發生明顯改變，MCABSA、MCAOVA1與各自載體蛋白相比最大吸收峰均發生偏移，MCAOVA2、MCAOVA3與OVA相比在相同的最大吸收峰處吸光度不同，表明所有人工抗原合成成功。

33小鼠血清效價及靈敏度測定

對于含有羧基的半抗原，文獻[21～23]均采用活潑酯法合成免疫原，而合成包被原時分別采用了活潑酯法、混合酸酐法和CDI/DMAP法，都成功獲得目標抗體。鑒于此，本研究采用活潑酯法合成免疫原，嘗試用上述3種方法合成包被原，發現以MCAOVA1為包被原時，雖然檢測到所有小鼠血清效價很高，均在1∶6000以上，但將最佳稀釋度的血清加入不同濃度的噻呋酰胺標準溶液后，測得各孔抑制率均比較低，表明此包被原所測血清靈敏度低； 以MCAOVA2為包被原時檢測到所有小鼠血清效價均低于1∶1000，說明該包被原檢測效果不佳； 以MCAOVA3為包被原時，檢測到1號、3號和號小鼠的血清效價均低于1∶1000，而2號小鼠的血清效價為1∶2000，并且對噻呋酰胺產生良好的抑制效果。

由此可見，在制備小分子抗體時，即使免疫動物已經產生目標抗體，但須使用合適的方法合成的包被原方可檢測出； 此外，動物的個體差異會影響抗體的產生。張存政等[2]在合成雙甲胺草磷人工抗原時，免疫原和包被原都采用活潑酯法合成，但在合成過程中加入了少量DMAP，這種改良的方法類似活潑酯法與CDI/DMAP法的結合，可減少雜分子與載體蛋白偶聯，有利于目標抗體的產生。

35特異性

抗體對種與噻呋酰胺分子結構類似的含氟農藥及半抗原的交叉反應結果如表1所示，與精吡氟禾草靈、氟鈴脲、三氟羧草醚和氟酰胺都無交叉反應，表明本研究獲得的多克隆抗體對噻呋酰胺具有較高的特異性。

36實際樣品檢測

自來水、東湖水和小麥樣品經PLC檢測均不含噻呋酰胺。加標回收實驗結果見表2，icELISA法檢測噻呋酰胺回收率在720%～1283%之間，RSD<111%。部分加標樣品（自來水：1 mg/L， 05 mg/L； 湖水：1 mg/L， 05 mg/L； 小麥：30 mg/kg， 3 mg/kg）經PLC法驗證，兩種方法的檢測結果呈現良好的線性關系（圖）， 說明icELISA法具有良好的實用性。 與現有的色譜法相比，ELISA法操作步驟簡單，無需使用大型儀器， h內即可完成檢測，簡便、經濟、高效。

結 論

本研究建立了噻呋酰胺人工抗原包被的icELISA檢測方法，可實現環境水樣與小麥等農產品中噻呋酰胺殘留的快速檢測，為噻呋酰胺單克隆抗體的制備和建立不同類型的免疫分析方法提供了參考。

Reference

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