生物鐘基因與骨免疫研究進展

景中坤 吳曉 馬文彬

成都中醫藥大學，四川 成都 610075

生物體的生命活動受到生物鐘的調控，包括睡眠-覺醒周期、體溫、心率、血壓、激素水平和認知的變化等。哺乳動物生物鐘的中樞起搏器位于下丘腦視交叉上核，外周的器官、組織、細胞的生物鐘同步于中樞生物鐘節律。生物鐘的形成需要鐘基因的參與。首先，Bmal1(brain and muscle ARNT-like-1，Bmal1)基因與Clock基因形成異二聚體，與周期基因(Period，per1-3)和隱花色素基因(Cryptochrome，cry1-2)啟動子的E-box結合，驅動PERs和CRYs基因的表達，同時形成PER/CRY蛋白復合物。PER/CRY蛋白復合物先聚集在細胞質中，隨后磷酸化遷移到細胞核中，抑制Clock-Bmal1的活性，關閉PER/CRY轉錄。這個反饋環路由核受體Rev-Erbα通過抑制Bmal1的轉錄調節實現[1]。當細胞核中的PER/CRY復合物降解后，PER/CRY蛋白復合物對Clock-Bmal1的抑制消除，開始新的晝夜循環。

迄今人們已經發現10多種核心生物鐘基因，主要包括Bmal1、Clock、PERs、CRYs、Csnk1、Rev-erbα、RORγt等以及轉錄翻譯后的產物。外界光、攝食等信號輸入中樞節律起搏器后，通過生物鐘基因轉錄、翻譯，然后與輸出系統構成一個完整的負反饋節律通路。Bmal1和Clock是生物鐘的主要正向調控元件，Cry1、Cry2、Per1和Per2則是主要的負向調控元件。

生物鐘基因參與了細胞生長、能量代謝、免疫調節、腫瘤形成等眾多的生理過程，生物鐘基因異常會直接導致生命體晝夜節律紊亂，還會使心血管疾病、代謝性疾病、免疫系統疾病和腫瘤等疾病的發生風險增大。

1 骨代謝的自身調控特點

人體骨骼是一個不斷更新的動態過程，成年人每年約有10%的骨骼會發生骨重塑，以維持骨骼的內穩態。骨吸收和骨形成的動態平衡在骨穩態中發揮著關鍵作用，成骨細胞(osteoblast，OB)和破骨細胞(osteoclasts，OC)介導了這一過程。

OC起源于單核-巨噬細胞產生的多核巨細胞。核因子-κB受體活化因子配體(receptor or activator of NF-κB ligand，RANKL)是OC的分化成熟的重要因子。OB、軟骨細胞、T細胞、B細胞等均表達RANKL。在腫瘤壞死因子受體相關因子-6存在時，RANKL與其受體核因子κB受體活化因子(nuclear factor κB receptor activator，RANK)結合并激活核轉錄因子-κB(nuclear factorkappa B，NF-κB)，上調c-fos基因、活化 T 細胞核因子c(activation of T cell nuclear factor c，NFATc)活性，促進OC分化。RANKL活性同樣受到骨保護素(osteoporogeterin，OPG)調控，OB和基質細胞分泌的OPG可作為誘餌受體通過結合RANKL而阻止RANKL與RANK結合，在體外阻斷OC分化成熟。所以，OPG/RANKL/RANK系統是調節骨代謝的重要反應器。

許多細胞因子能對OC的活性產生作用，如白介素-1(Interleukin 1，IL-1)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-17(Interleukin-17，IL-17)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、1,25二羥基維生素D3[1,25 dihydroxyvitamin D3，1,25(OH)2D3]、RANKL等誘導OC分化；白介素-4(Interleukin-，IL-4)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、OPG等對OC的活性產生負向調控；IL-6和TGF-β因OC分化的階段產生不同影響。不同的基因、生長因子、細胞因子等通過NF-κB、BMP/Smads、Wnt/β-catenin及OPG/RANKL/RANK等信號通路對骨代謝結局產生不同影響。

2 免疫系統對骨代謝的調節作用

免疫與骨代謝關系復雜多樣，為了從細胞分子水平研究兩者的相互作用和機制，誕生了骨免疫學。骨細胞和免疫細胞均從骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)分化而來，巨噬細胞、髓樣樹突細胞與OC共同來源于髓系前體細胞，OB、血液細胞和免疫細胞均來源于骨髓中的造血干細胞。

生理條件下，T細胞通過CD40配體與CD40結合可促進B細胞產生OPG，骨髓中45%的OPG來源于成熟B細胞。B細胞可直接參與OC的生成，也可通過RANKL介導OC分化[2]。B細胞敲除的小鼠出現骨質疏松癥和骨髓OPG缺陷，T細胞缺陷的老鼠同樣如此，導致骨吸收增強[3]。但活化的T細胞和B細胞分泌促進OC的生成因子，包括促進骨丟失的RANKL、IL-17 A和TNF-α等炎癥因子，骨吸收作用增強。T細胞分泌的細胞因子中，RANKL、TNF-α、IL-6等促進骨吸收，TGF-β、IL-4、IL-10和IFN-γ等阻礙骨吸收。T細胞活化后激活RANKL/RANK信號通路，對骨吸收產生正向調控。源自CD4+T細胞中的TNF-α、RANKL可誘導OC的形成增加，TNF-α是炎癥中產生OC最有效的因子之一，在存在正常水平的RANKL的情況下，TNF-α直接刺激巨噬細胞和OC的分化[4]。

IL-6被認為是炎癥反應中生物效應的放大因子，是RANKL表達的受體激活劑。滑膜細胞產生的IL-6可以作為RANKL表達的受體激活劑，激活粘附分子，將白細胞募集到骨關節處，破壞細胞外基質。RANKL可以使基質金屬蛋白酶9、組織蛋白酶K、酒石酸鹽酸性磷酸酶、碳酸酐酶II對IL-1產生反應，共同上調NFATc1的表達，誘導滑膜細胞增殖和OC分化[5]。研究表明[6]，TNF/IL-6復合物可以通過IL-6R、NFATc1、DNAX活化蛋白12和細胞增殖途徑，誘導OC在RANK敲除小鼠的骨髓和滑膜培養物中產生。同時，IL-6、白血病抑制因子、制瘤素M在炎癥性關節炎的滑膜中表達增加。說明TNF與IL-6類細胞因子可以通過非RANKL依賴性途徑誘導的OC產生，導致骨破壞。Wnt信號與成骨密切相關，IL-6與TNF-α可以一起抑制滑膜細胞和OB中Wnt信號的激活。而shRNA介導的IL-6基因敲除的小鼠可以在炎癥環境中促進骨形態發生蛋白異源二聚體的表達，誘導OB的發生[7]。用重組小鼠IL-6和IL-6R處理骨樣細胞MLO-Y4并與OC前體細胞共培養，發現IL-6和IL-6受體在骨樣細胞MLO-Y4的mRNA和蛋白水平上增強了RANKL的表達和RANKL/OPG表達比。但使用JAK2抑制劑后發現OC分化能力下降。這表明IL-6也可通過激活JAK2和RANKL介導OC分化[8]。

對比健康人群與類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)患者發現[9]，RA患者更容易發生骨質疏松，這與RA患者體內的免疫細胞因子水平升高相關。同時，RA患者的I型膠原羧基端交聯肽(C-terminaltelopeptides collagen，CTX)水平升高，Ⅰ型前膠原N端前肽(N-terminal propeptide of type 1precollagen，P1NP)水平降低，這也增加了骨質疏松發生的幾率。

3 生物鐘基因參與骨節律和骨代謝

3.1 生物鐘基因調節骨組織的節律

骨組織具有自己的生物鐘，受到Bmal1、Clock、PERs等時鐘基因的調控。將離體小鼠的軟骨細胞置于三維海綿上培養后，通過分析胞漿、胞核和細胞骨架的12 000多種基因的微點陣，均能發現節律鐘基因Clock、Per1和Per2在軟骨細胞上的表達，并呈現明顯的節律性[10]。在3～9周齡小鼠的股骨中發現[11]，Per2基因轉錄的節律明顯，并且對由于外界影響導致的節律紊亂具有可逆性，表明在骨組織具有相對穩定的生物鐘。將小鼠進行光暗周期處理，從松質骨提取mRNA并分析OC相關基因和時鐘基因，OC相關基因顯示出與時鐘基因Per1、Per2和Bmal1同步的節律性。研究表明[12]，OC上Bmal1基因和酪氨酸激酶家族相互作用進而與NFATc1啟動子結合控制骨吸收。時鐘基因Bmall的功能蛋白與NFATc1啟動子上的E-box結合，上調鈣調神經磷酸酶的活性，使NFATc去磷酸化，激活CN/NFATc信號通路。

許多骨轉換標志物在血漿或尿液中表現出晝夜變化。研究通過每間隔2 h測量10名健康男性血清中的硬骨素、CTX和P1NP，CTX存在明顯的晝夜節律，并且在5:30達到峰值[13]。研究人員通過對志愿者進行3周的睡眠限制，對比了20～27歲的年輕人與55～65歲的老年人之間4種骨生物標志物，包括CTX、P1NP、硬骨素和成纖維細胞生長因子23。發現年輕人P1NP的下降幅度比老年人更大，骨形成減少但骨吸收不變，表明晝夜節律紊亂可能在成年早期對骨代謝影響更大[14]。

3.2 生物鐘基因破壞對骨代謝的影響

時鐘基因功能異常會影響骨量。研究發現Per2基因突變和Cry2基因敲除的小鼠在12周齡時骨量顯著增加，骨轉換率增高。并且Cry2和Per2通過不同的途徑調節骨體積，Cry2主要影響OC，而Per2作用于OB[15]。從妊娠4.5 d的Per2轉基因大鼠分離子宮內膜間質細胞，Per2-dLuc生物發光活性顯著下降。用Bmal1特異性siRNA轉染的子宮內膜間質細胞發現，Rev-erbα表達下調，骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)中BMP2、BMP4和BMP6上調，其中Rev-erbα在BMPs基因轉錄沉默中起重要作用。表明BMPs基因通過生物鐘基因的衰減而上調，有利于向軟骨組織和骨組織分化[16]。

研究者通過轉錄組測序在小鼠椎間盤中發現607個基因的表達在生理狀態中具有節律性。敲除Bmal1的小鼠表現出與年齡正相關的椎間盤退變，說明了生物鐘基因的破壞可能會影響椎間盤生理病理[17]。隨著機體的衰老，老化的BMSCs會減弱向骨細胞分化增殖的能力，導致骨骼衰老。當Rev-erbα過表達時，會促使BMSCs提前衰老，細胞增殖能力下降，進而導致骨形成減少，表明Rev-erbα與機體衰老有一定關系[18]。在Bmal1過表達的小鼠胚胎成纖維細胞中，Bmal1蛋白水平與BMSCs增殖活性之間呈正相關。這可能是由于Bmal1的過表達激活了經典Wnt途徑中β-catenin因子，使其表達增加[19]。另外，研究者通過敲低Clock和Per2兩個主要時鐘基因，觀察到BMSCs分化成脂肪細胞的能力受到顯著抑制，而OB分化能力沒有改變[20]。

1,25(OH)2D3對OC和OB形成均有調節作用。在Bmal1缺陷型骨細胞中，1,25(OH)2D3可以誘導RANKL的活性增強，導致骨破壞，而Bmal1/Clock的過表達則可以在OB中抑制這種情況[21]。Clock基因作為重要的節律調控基因，也可以控制1,25(OH)2D3的受體——蛋白質二硫鍵異構酶A3的轉錄，調節骨的形成。蛋白二硫鍵異構酶A3也被證明是一種鐘控基因，受上游節律鐘基因的控制。而Clock基因突變導致小鼠細胞凋亡增加，骨密度明顯降低[22]。

4 免疫與生物鐘基因相互作用影響骨免疫

4.1 生物鐘基因調控免疫系統的節律

生理狀態下，免疫系統具有晝夜節律，免疫功能一定程度上受到生物鐘基因的調控。巨噬細胞、NK細胞、肥大細胞、T細胞和B細胞等細胞的晝夜節律受時鐘基因的調節，并且TNF-α、IL-6、IL-13、IFN-γ等細胞因子分泌的節律同樣受到生物鐘基因的調控。在健康人的CD4+T細胞中發現時鐘基因E4bp4、Per2、Per3、Rev-erbα和Rorα的mRNA表達，在時鐘基因的刺激下，IL-2、IL-4和IFN-γ的表達具有穩定的節律性[23]。

IL-17是連接T細胞活化和OC的Th細胞亞群，主要由輔助性T細胞17(T help cell 17, Th17)產生。在野生小鼠小腸固有層中發現，Th17細胞的節律受到Clock基因的調節[24]。時鐘基因E4bp4參與了Th17細胞的發育。E4bp4通過與RORγt結合會抑制Th17細胞的發育，但E4bp4可以通過Rev-erbα將Th17細胞發育與生物鐘網絡相連接[25-26]。

4.2 抑制生物鐘基因能夠促進免疫炎癥反應

Cry1過度表達則抑制晝夜節律紊亂導致的血管炎癥，這與NF-κB信號通路和cAMP/PKA途徑激活有關[27]。時鐘基因Cry1和Cry2的缺失會引起蛋白激酶A活化，介導p65磷酸化，誘導NF-κB活化和IL-6、TNF-α的表達[28]。

Rev-erbα是具有改變時鐘功能的核激素受體之一，主要參與脂質代謝、脂肪形成和炎癥反應。Rev-erbα可在炎癥狀態下直接抑制Ccl2啟動子中的Rev-erbα結合區域，抑制Ccl2下游的MAPK/ERK和p38MAPK信號介導的炎癥反應，調節巨噬細胞的炎癥浸潤，Rev-erbα缺損的小鼠巨噬細胞中Ccl2表達增加證實了Rev-erbα的作用[29]。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)能夠刺激TNF-α、IL-2和IFN-γ等細胞因子的表達，導致炎癥反應。實驗表明[30]，Per2是NK細胞節律功能的重要調節因子。用LPS攻擊Per2缺陷小鼠，與野生型小鼠相比，Per2缺陷小鼠血清中促炎細胞因子IFN-γ和IL-1β的水平明顯降低，而TNF-α、IL-6和IL-10大致正常。肝癌骨質疏松發病率明顯升高，且發病率隨肝功能損害的逐漸加重而逐漸升高。在Per2突變的肝癌小鼠模型上發現[31]，肝臟IL-6蛋白濃度的失常，肝臟增殖基因包括c-Myc、Wee1、Ccnb1和K-ras mRNA的表達失調，同時炎癥反應增強。在RA缺氧的關節腔內，Clock可誘導血管氧化損傷、炎癥反應和骨質破壞。進一步研究發現這是通過上調IL-1β、IL-6、TNF-α、細胞間粘附分子1的表達水平，隨后激活NF-κB信號，對OC產生調控，導致骨吸收增強[32]。

4.3 免疫炎癥反應使生物鐘基因功能障礙進而影響骨代謝

免疫反應也能通過影響生物鐘基因對骨代謝產生影響。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)是人類和動物RA模型中的炎癥介質之一。在炎癥環境中FLSs被激活，導致其表觀遺傳修飾，侵襲性增強，釋放多種細胞因子和生長因子，破壞軟骨和骨[33]。在RA小鼠模型上發現[34]，黑暗條件下兩個負性調控的時鐘基因CRY1和CRY2抑制了FLSs介導的炎癥反應。在RA和骨關節炎患者身上發現[35]，炎癥刺激擾亂了FLSs的節律，并且在生物鐘重置之后IL-6和IL-1β分泌的晝夜節律破壞，而ARNTL2和NPAS2似乎是炎癥條件下受影響最大的時鐘基因。其中，TNF-α能直接干擾FLSs的時鐘基因表達[36]。表明炎癥狀態使時鐘基因功能障礙，影響正常的生物節律。在RA滑膜細胞中進一步發現，TNF-α還增強Bmal1和Cry1的mRNA表達，但不影響Clock、Per1和Cry2的表達[37]。另外，TNF-α在滑膜成纖維細胞中以NF-κB依賴性方式在mRNA和蛋白質水平上刺激鐘控基因DEC2的表達[38]。但在鈣信號存在時，TNF-α與TNFR1相互作用導致Dbp表達快速下調，時鐘基因Per1、Cry1上調，同時使分化型胚胎軟骨發育基因1表達增強，有利于向軟骨細胞分化[39]。

研究顯示，TNF和IL-1β可以抑制Per1-3、Cry1-2、PAR-bZip等多種時鐘基因以及鐘控基因的表達[40]。這是由于TNF導致Twist1的過表達與CLOCK競爭性結合PERs和Dbp的E-box，導致時鐘基因轉錄受阻[41]。在衰老小鼠OA模型中，Per2轉錄的晝夜節律性在軟骨組織中顯著降低[42]。除了年齡的影響，還由于炎癥狀態下，IL-1β消除Cry1轉錄和Per2轉錄表達的晝夜節律，而NF-κB信號通過干擾Clock/Bmal1復合物的功能參與了這一過程[43]。

5 結語

免疫系統與骨骼系統有復雜的關系，免疫系統對骨代謝結局有雙向作用，細胞因子的種類起著關鍵作用。生物鐘基因既能調節免疫系統和骨骼系統的生物節律，也可以直接對骨免疫產生影響，還可以通過骨免疫相關的細胞因子對骨量產生不同作用。免疫反應也能抑制或增強生物鐘基因的功能，從而影響骨代謝。但由于生物鐘基因眾多，目前的研究對生物鐘基因的功能尚不能完全解釋。同時，骨免疫過程生理機制復雜多變，免疫系統的細胞因子與骨細胞的關系需更多研究闡明，生物鐘基因如何影響骨免疫來調節骨細胞功能的機制需深入研究。