2型糖尿病ZDF大鼠模型的最佳成模時間及解毒通絡調肝方的干預作用

金美英 樸春麗 趙宗江 米 佳 劉向榮 陳 曦

(長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 133021)

理想的糖尿病動物模型是研究糖尿病的有力工具，在2型糖尿病(T2DM)的科研中起著重要的作用。國內相關ZDF大鼠模型制備研究較少，并且國際上不同的實驗室誘導的時間和條件不同，成模的情況也不一致。本課題通過Purina #5008飼養9周齡雄性ZDF大鼠，誘導人類T2DM機制，制備自發性T2DM動物模型，動態分析ZDF大鼠體重與血糖的變化,對ZDF大鼠T2DM模型的穩定性及持續性進行分析，試圖摸索出最佳成模時間。T2DM的兩個發病關鍵環節是胰島素抵抗和胰島β細胞功能減退。中醫藥對于T2DM的發生和控制T2DM的進展有獨特的見解，解毒通絡調肝方是根據中醫“毒損絡脈”病機，從“肝”論治糖尿病理論結合臨床實踐確立的治療T2DM的大法，在T2DM的臨床應用中顯示出良好的療效〔1～3〕。因此，本實驗擬觀察解毒通絡調肝方對ZDF T2DM動物模型的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1動物與飼料 SPF級健康、雄性9周齡Zucker Diabetes Fat(ZDF)大鼠88只，SPF級健康、雄性9周齡Zucker Lean(ZL)大鼠10只(北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK京 2014-0003)。高脂飼料Purina #5008〔購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號 SCXK(京) 2009-0008〕，實驗大鼠置于潔凈動物櫥(北京文慧凈化設備廠制造，專利號：EJ932041477)中飼養，飼養環境為室溫(23～25)℃，相對濕度50%～60%，每日12 h光照維持，所有大鼠自由飲水。

1.2實驗藥物 治療藥為解毒通絡調肝方(由榛花15 g、大黃30 g、黃連15 g、雙花15 g、黃芪30 g、丹參15 g、柴胡10 g組成，長春中醫藥大學附屬醫院制劑室提供，4℃冰箱保存)；對照藥為鹽酸二甲雙胍片(天津太平洋制藥有限公司，批號 080313)。

1.3動物模型的建立 88只9周齡雄性ZDF大鼠以Purina #5008飼養，10只9周齡雄性ZL大鼠以維持飼料#1022飼養。動態觀察隨機血糖及體質量的變化，以隨機血糖≥11.1 mmol/L作為T2DM成模標準〔4〕，第5周及第8周各隨機抽取10只、15只ZDF大鼠測量隨機血糖水平。飼養第10周對88只ZDF大鼠進行隨機血糖監測，根據血糖水平分為<11.1 mmol/L、11.1～16.9 mmol/L、>16.9 mmol/L三種血糖梯度，然后將大鼠重新分籠飼養，第11周對血糖濃度<11.1 mmol/L的大鼠再次進行隨機血糖監測，選出符合成模標準的大鼠，并將第10周及第11周已符合成模標準的大鼠重新隨機分組飼養，至第12周將已成模大鼠及未成模大鼠再次進行隨機血糖監測，判斷其模型的穩定性。

1.4實驗分組 造模前將ZL大鼠(10只)設為對照組； ZDF大鼠(88只)設為造模組，飼養誘導制備T2DM動物模型。第13周將ZL大鼠與已成模的ZDF大鼠進行分組，ZL(10只)大鼠作為正常組；成模ZDF大鼠按血糖水平隨機分為5組，模型組(15只)，鹽酸二甲雙胍(西藥)組(11只)，解毒通絡調肝方大小劑量組，每組各11只。

1.5給藥 飼養第13周開始進行藥物灌胃，模型組與正常組以等體積蒸餾水灌胃，1次/d，西藥組：臨用前將二甲雙胍攪拌至完全溶解，用蒸餾水稀釋，給藥劑量為0.5 g/kg，1次/d。解毒通絡調肝方小、中、大劑量組：蒸餾水稀釋，灌胃劑量為1、3、5 g/kg，按所含原藥材量計算，1次/d。灌胃時間均為每日上午9：00，治療周期為4 w。觀察大鼠一般狀態，每周稱量記錄體質量。

1.6觀察指標 開始飼養后每周進行一次稱重觀察體質量變化情況，飼養期間結合一般狀態在第5、8、10、11、12、17周均進行隨機血糖的監測。藥物灌胃結束后第17周禁食12 h，各組大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉。經股動脈取血，加入10 ml干凈離心管，靜置2 h后，2 500 r/min低溫高速離心20 min，抽取上層血清，檢測血糖(GLU)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的變化。

1.7統計分析 采用 SPSS20.0 軟件行方差分析。

2 結 果

2.1動物模型制備 ZL大鼠精神狀態好，動作靈敏好動，毛發有光澤。ZDF大鼠剛進入動物房的前幾周活動靈活，隨著周齡增加體質量逐漸增大〔造模第0、11、17周體質量分別為(262.78±3.70)、(447.00±4.06)、(458.93±8.96)g，第11、17周體質量與第0周比較差異顯著(P<0.05)〕，形體變胖，毛色逐漸枯黃無光澤，漸漸開始懶惰，逐漸萎靡不振，逐步出現三多癥狀。在血糖方面，第5周〔(10.37±4.35)mmol/L〕與第8周〔(12.14±4.90)mmol/L〕比較有逐漸升高趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)；飼養第10周出現并發癥傾向，測隨機血糖〔(15.30±7.12)mmol/L〕與第8周比較均有顯著性升高(P<0.05)，符合成模標準54只，血糖<11.1 mmol/L的34只；第11周對未成模的34只ZDF大鼠復查血糖，符合成模標準20只，血糖<11.1 mmol/L的14只；經第10周與第11周兩次篩查符合成模標準的大鼠73只(82.95%，共74只，死亡1只)，第11周(已成模)血糖均值為(18.18±5.47)mmol/L，繼續飼養第12周復查血糖有小幅度升高，但與第11周(已成模)比較無顯著差異(P>0.05)。第12周(未成模)〔(9.52±1.16)mmol/L〕與第11周(未成模)〔(9.02±0.99)mmol/L〕比較也無顯著差異(P>0.05)。第17周(模型組)隨機血糖〔(24.27±6.38)mmol/L〕進行性升高，與第12周(已成模)〔(18.76±5.27)mmol/L〕比較，有顯著性升高(P<0.01)。9周齡雄性ZDF大鼠以Purina #5008飼養誘導11 w，符合2型糖尿病成模標準的大鼠達到82.95%，繼續以Purina #5008飼養，經12 w、17 w反復復查隨機血糖，證明其穩定性及持續性，得出9周齡雄性ZDF大鼠以Purina #5008飼養11 w誘導T2DM動物模型成模率較高，持續性及穩定性較好。ZDF大鼠飼養成模后，11 w與12 w已成模大鼠死亡2只，14 w模型組死亡1只，共死亡3只，ZDF大鼠死亡率為3.4%。ZL對照組大鼠無死亡。

2.2解毒通絡調肝方對各組大鼠體質量的影響 與正常組比較，模型組、西藥組、解毒通絡調肝方大、中、小劑量組體質量有顯著差異(P<0.01)；與模型組比較，西藥組、解毒通絡調肝方大、中、小劑量組體質量有下降趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 解毒通絡調肝方對各組大鼠體質量的影響

與正常組比較:1)P<0.01

2.3解毒通絡調肝方對各組大鼠糖代謝的影響 與正常組比較，模型組、西藥組、解毒通絡調肝方大、中、小劑量組GLU、HbA1c、胰島素(INS)顯著升高(P<0.01)；西藥組與解毒通絡調肝方大劑量組GLU明顯低于模型組(P<0.05)，西藥組與大劑量組無統計學差異；西藥組、中劑量組GSP低于模型組(P<0.05)。見表2。

2.4解毒通絡調肝方對兩組大鼠脂代謝的影響 與正常組比較，模型組、西藥組、解毒通絡調肝方大、中、小劑量組TC、TG、HDL-C均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組、解毒通絡調肝方大、中、小劑量組TC、HDL-C下降明顯(P<0.01，P<0.05)，大劑量組、西藥組與模型組比較TG下降明顯(P<0.05)；與西藥組比較，解毒通絡調肝方大劑量組TC、TG、HDL-C下降明顯(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2 解毒通絡調肝方對糖、脂代謝的影響

與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01；與西藥組比較：4)P<0.05,5)P<0.01

3 討 論

糖尿病是一種由多源性病因引起的疾病，受社會因素、遺傳因素、生活方式因素及環境因素等影響。

糖尿病中醫稱之為消渴病，以“毒邪”理論與“絡病”理論為契機，“毒損絡脈”為病機切入點，結合“肝臟”在消渴病發病中的作用，提出從“肝”論治糖尿病〔3～5〕，以解毒通絡調肝法為治療大法，方中選榛花、大黃為君藥，重在解毒，活血化瘀，通經活絡，祛濁化濕；黃連、雙花清熱解毒，燥濕祛濁；黃芪、丹參益氣通絡，疏通經絡，扶正祛邪，共同增強君藥解毒作用均為臣藥；柴胡引藥入肝經，疏利氣機，為佐使藥。全方攻補兼施、扶正祛邪，激活機體的排毒能力，通絡以通暢絡脈、推陳出新，調肝以調暢氣機，求其平衡，乃正本求源之大法。解毒通絡調肝方在T2DM的臨床應用中顯示出良好的療效〔3～5〕。

目前，ZDF大鼠被公認為是先天遺傳性T2DM和肥胖病模型動物，雄性ZDF大鼠必須經過Purina #5008特殊飼料誘導，才能出現高INS血癥和高血糖癥〔6〕，有報道稱，Purina#5008飼料飼養條件下，雄性ZDF大鼠一般情況下6 w顯現高INS血癥；7 w開始顯現高血糖，10 w發展為糖尿病(DM)，隨著DM的發展，12 w逐步出現INS分泌障礙〔7〕。雌性ZDF大鼠在Purina#5008飼喂下不發展為DM〔8,9〕。ZL大鼠是非肥胖且非DM的模型動物，外表與ZDF大鼠相似，經常被用來作為ZDF大鼠的對照組模型動物。

本實驗中發現 ZDF大鼠以Purina #5008飼養后第1～3周體質量增長迅速，飼喂第3周之后體質量增長放緩，隨著周齡的增加，ZDF大鼠與ZL大鼠體重相差明顯。ZDF大鼠Purina #5008飼養后由糖耐量異常逐步發展為高血糖狀態，第11周成模率較高，已成模大鼠在第12、17周持續存在高血糖狀態，同時隨機血糖有進一步升高趨勢，可排除應激性血糖升高可能性，從而證明ZDF大鼠T2DM動物模型的穩定性及持續性。同時發現ZDF大鼠T2DM動物模型除了高血糖還具有高INS血癥、高TC血癥及高TG血癥等特征，符合人類T2DM相關特征，造模后模型的穩定性及持續性較好，同時死亡率較低，安全性較好，是理想的T2DM動物模型。解毒通絡調肝方干預后，可降低血糖、調節血脂，從而控制T2DM發生、發展，為深入研究解毒通絡調肝方治療T2DM療效機制提供了實驗依據，為中醫“毒損絡脈”理論研究及從“肝”論治T2DM的臨床應用提供了有力的實驗依據。

1樸春麗,楊叔禹,仝小林,等.解毒通絡調肝方對實驗性糖尿病大鼠肝臟IRS表達的影響〔J〕.中華實用中西醫雜志，2009;22(14):1176-9.

2于 淼,樸春麗,南 征.解毒通絡調肝方對胰島素抵抗大鼠肝臟NF-κB及MCP-1表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2010;30(8):2306-7.

3于 淼,樸春麗,南 征.2型糖尿病胰島素抵抗從毒損肝絡論治的理論初探〔J〕.上海中醫藥雜志,2007;41(3):18-20.

4Matteucci E，Giampietro O.Proposal open for discussion:defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research〔J〕.J Ethnopharmacol，2008;115(2):163-72.

5潘長玉.糖尿病學〔M〕.北京：人民衛生出版社，2007：5-6.

6William TC.Animal modeles of type 2 diabetes clinical presentation and pathophysiological relevance to human condition〔J〕.ILMU，2006;47(3):186-7.

7Pick A，Clark J，Kubstrup C，etal.Role of apoptosis in failure of beta-cell mass compensation for insulin resistance and beta-cell defects in the male Zucker diabetic fatty rat〔J〕.Diabetes，1998;47(3)：358-64.

8Huang TH,Peng G,Kota BP,etal.Anti-diabetic action of Punica granatum flower extract:activation of PPAR-g and identification of an active compound〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol,2005;207(2):160-9.

9Coimbra TM,Janssen U,Grone HJ,etal.Early events leading to renal injury in obese Zucker(fatty) rats with typeⅡ diabetes〔J〕.Kidney Int,2000;57(1):167-82.