丁苯酞對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)Bax和Bcl-2表達的影響

姚 剛 朱博馳 于挺敏 滿玉紅

(吉林大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130041)

丁苯酞(NBP)是人工合成的消旋正丁基苯酞，是治療缺血性腦卒中的國家級一類新藥，能夠明顯減輕急性缺血性腦卒中患者中樞神經(jīng)功能缺損〔1〕。目前發(fā)現(xiàn)NBP對血管性癡呆(VD)也有較明顯的改善作用〔2，3〕，但其作用機制還缺乏深入的研究。腦血管病后慢性腦缺血是VD最常見的病因，其病理機制與腦缺血引發(fā)的認知功能相關腦區(qū)神經(jīng)細胞凋亡、氧化應激、能量代謝障礙、興奮性氨基酸、炎性因子、膽堿能通道功能受損等多種因素有關，其中細胞凋亡學說是人們研究的熱點〔4，5〕。B淋巴細胞淋巴瘤(Bcl)-2家族，通過線粒體相關信號通路調(diào)節(jié)細胞凋亡〔6〕，其中以Bax基因為代表的促凋亡基因與以Bcl-2基因為代表的抗凋亡基因相互拮抗，實現(xiàn)對細胞凋亡的調(diào)控。本研究通過觀察NBP對VD大鼠海馬CA1區(qū)Bax和Bcl-2表達的影響，探討NBP對VD大鼠的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器 80只健康SPF級Wistar大鼠(雌雄各半)，體重200～220 g，購于吉林大學基礎醫(yī)學院動物中心，動物合格證號：SCXK(吉)2003-001。丁苯酞氯化鈉注射液(石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H20100041)。大鼠抗Bcl-2多克隆抗體、抗Bax多克隆抗體購自北京博奧森生物公司。

1.2分組 大鼠飼養(yǎng)于吉林大學第二醫(yī)院動物實驗室，室內(nèi)溫度22℃～26℃，相對濕度40%～60%，光暗周期12 h，自由攝取食物和水，動物模型制備前適應性喂養(yǎng)7 d。按隨機分組法分為VD組、NBP治療組、NBP對照組、Sham組，每組20只，每組又分為4個亞組：術后1、2、4、8 w，每個亞組5只。

1.3動物模型制備 采用永久性雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型。VD組和NBP治療組大鼠術前禁食、禁水8 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺，常規(guī)消毒頸部手術區(qū)域，頸前正中作一長約1 cm的縱形切口，鈍性逐層分離皮下軟組織、頸前肌群，分離出氣管側后方的頸動脈鞘，進而分離頸總動脈與迷走神經(jīng)，以1號絲線永久結扎頸總動脈，同法結扎另一側頸總動脈。局部消毒后恢復組織層次并縫合皮膚。Sham組和NBP對照組大鼠除不結扎雙側頸總動脈外，其余操作與VD組和NBP治療組大鼠一致。術后動物另放于干凈鼠籠飼養(yǎng)，自由獲取水源及飼料。

1.4藥物干預 NBP對照組和NBP治療組大鼠清醒后(術后1 d，可在籠中自由活動)，給予丁苯酞氯化鈉注射液腹腔注射，劑量為5 mg·kg-1·d-1(藥物劑量根據(jù)成人常規(guī)每日劑量進行換算)，Sham組和VD組大鼠給予生理鹽水腹腔注射(0.2 ml/d)。各組大鼠連續(xù)腹腔注射給藥7 d。

1.5標本采集及免疫組化 各組大鼠在術后各時間點(1、2、4、8 w)，給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉劑量0.3 ml/100 g)，生理鹽水心臟灌注5 min，斷頭取腦，分離出海馬，將組織塊迅速置入10%中性甲醛固定48 h，PBS洗脫3次，80%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片。免疫組化方法采用SP法。

1.6顯微圖像采集及分析 每張切片于400倍鏡下隨機選取5個視野，利用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)檢測陽性表達灰度值，同時計算每個視野下的陽性細胞總數(shù)占所有細胞總數(shù)的比率，細胞表達平均灰度計算采用視野灰度×陽性細胞比率，以5個視野的平均值表示。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件包組間差別采用單因素方差分析和Tukey比較。

2 結 果

2.1Bax蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達 Bax蛋白陽性表達顯示為黃棕色顆粒，主要定位于細胞質(zhì)。VD組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目較少，排列紊亂，部分細胞出現(xiàn)空泡樣變性，Bax表達呈強陽性，主要位于神經(jīng)元。NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷明顯減小，Bax表達顯著減弱。見圖1，圖2。

圖1 1 w、2 w Bax蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達(DAB，×400)

VD組和NBP治療組大鼠1 w、2 w、4 w和8 w時海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達灰度明顯高于Sham組(P<0.05)；NBP治療組大鼠4 w和8 w時海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達均明顯低于VD組大鼠相應時間點(P<0.05)。VD組大鼠不同時間點CA1 區(qū)Bax表達灰度比較，8 w組明顯高于1 w和2 w組(P<0.05)。見表1。

2.2Bcl-2蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達 Bcl-2蛋白陽性表達顯示為黃棕色顆粒，主要定位于細胞質(zhì)。VD組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達弱或無表達，NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū) Bcl-2表達顯著增加，NBP對照組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達最強，NBP對照組和Sham組大鼠海馬組織結構完好，神經(jīng)細胞分布正常，Bcl-2表達中等程度或低表達。見圖3，圖4。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bax表達灰度比較

與Sham組比較：1)P<0.05；與VD組比較：2)P<0.05；與同組8 w比較；3)P<0.01；下表同

圖3 1 w、2 w Bcl-2蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達(DAB，×400)

圖4 4 w、8 w Bcl-2蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達(DAB，×400)

各時間點，NBP對照組大鼠海馬CA1 區(qū)Bcl-2表達灰度均明顯高于Sham組(P<0.05)；2 w、4 w和8 w時NBP對照組大鼠海馬CA1 區(qū)Bcl-2表達灰度均明顯高于VD組(P<0.05)；8 w時NBP治療組大鼠海馬CA1 區(qū)Bcl-2表達灰度明顯高于VD組(P<0.05)。各組大鼠海馬CA1 區(qū)Bcl-2表達灰度在不同時間點比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達灰度比較

3 討 論

永久性雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型是目前公認的VD造模方法，大鼠腦血管系統(tǒng)與人類一樣，具有發(fā)達的腦動脈環(huán)(Willis環(huán))，當雙側頸總動脈結扎后，并不會造成前腦組織的血供完全阻斷，而是處于缺血狀態(tài)〔7〕，接近VD慢性腦灌注不足的發(fā)病機制。海馬、額葉等腦區(qū)的缺血性損傷是發(fā)生VD的基礎。

研究發(fā)現(xiàn)，瀕死狀態(tài)的神經(jīng)元中Bax呈高度表達〔8〕，Bax過度表達可以拮抗Bcl-2抑制凋亡作用，促進凋亡的發(fā)生。實驗研究發(fā)現(xiàn)，前腦缺血可以導致海馬CA1區(qū)誘導凋亡的Bax蛋白表達增加，Bax蛋白表達高峰先于DNA碎裂高峰，因而認為，Bax蛋白過度表達引起了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元DNA斷裂和凋亡〔9〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，NBP能夠對前腦缺血導致的海馬CA1區(qū)Bax蛋白過度表達起到抑制作用。

Bcl-2與Bax具有高度同源的氨基酸序列，其抗凋亡作用受到Bax的拮抗，Bcl-2/Bax的比值對神經(jīng)細胞凋亡起著關鍵的作用〔10〕。Bcl-2在線粒體水平對抗各種凋亡刺激，對細胞起保護作用，其抗凋亡機制包括抑制Ca2+超載、抑制氧自由基、控制凋亡信號傳導途徑、抗谷氨酸毒性等多個方面〔11〕。Manji等〔12〕認為提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)Bcl-2的表達水平，能夠提高神經(jīng)元承受損傷的能力，還可以促進神經(jīng)軸突的再生。本研究發(fā)現(xiàn)，NBP對照組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達最強，VD組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達有下降趨勢，但未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學意義。8 w時，NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達顯著增加，提示NBP可以提高大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白的表達水平。本實驗在制備VD大鼠的基礎上，應用NBP給予干預治療，觀察不同時間點大鼠海馬CA1區(qū)凋亡調(diào)控基因Bcl-2家族中促凋亡的Bax和抗凋亡的Bcl-2表達情況。結果發(fā)現(xiàn)：VD大鼠海馬CA1區(qū)促凋亡蛋白Bax過度表達，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達有減弱趨勢；NBP對VD大鼠海馬CA1區(qū)細胞凋亡具有明顯的保護作用，可以抑制缺血損傷導致的海馬CA1區(qū)Bax蛋白過度表達，同時能夠提高大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白的表達水平，抑制細胞凋亡，促進細胞存活，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

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