阿托伐他汀對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織Wnt4/β-catenin信號通路的干預作用

李圓圓 石春花 石明雋 張昌志 曾令萍 肖 瑛 郭 兵

(貴州醫科大學病理生理教研室，貴州 貴陽 550025)

Wnt信號通路在各種器官纖維化上皮細胞向間充質細胞轉分化(EMT)過程中扮演重要作用，該信號通路的異常激活與心臟、腎臟、肺等器官纖維化的發生發展密切相關〔1～3〕。Wnt4是Wnt家族蛋白之一，對泌尿生殖系統發展至關重要〔4〕。阿托伐他汀是新近使用的高效他汀類降脂藥物，有研究提示，他汀類可通過多種途徑發揮抗炎、抗纖維化等腎臟保護作用〔5〕，但具體機制仍不明確。本實驗通過觀察阿托伐他汀藥物對單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠Wnt4/β-catenin信號通路的影響，探討阿托伐他汀改善腎纖維化的可能機制。

1 材料和方法

1.1動物 清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重(200±20)g，貴州醫科大學動物中心提供，合格證號：SCXK 2007-0005。

1.2試劑 阿托伐他汀鈣片(阿樂，北京嘉林藥業)，牛血清蛋白、超敏電化學發光法(ECL)、一抗稀釋液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、兔抗-E-cadherin、兔抗-α-平滑肌自身抗體(SMA，武漢博士德)，兩步法免疫組化檢測試劑、辣根過氧化物標記羊抗兔IgG，鼠抗-β-actin(北京中杉金橋)，兔抗-β-catenin、兔抗-Wnt4(北京博奧森公司)，兔抗-糖原合成激酶(GSK)-3β、兔抗-p-GSK-3β(美國Santa Cruz)。

1.3實驗方法

1.3.1UUO大鼠模型復制 參考薛痕等〔6〕方法，采用8%水合氯醛，按5 ml/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠，劍突下4 cm做腹正中切口(約5 cm)，鈍性分離皮下組織及肌層，展開止血鉗托住輸尿管中上段，4-0號絲線在相距1 cm的距離分別結扎輸尿管的兩端，從結扎兩端的中點位置將輸尿管剪斷，縫合皮膚。術后1～2 h大鼠清醒，6 h后給予進水，12 h后予進食。

1.3.2分組 將60只SD大鼠，雌雄各半，在清潔條件下適應性喂養1 w，常規飲食飲水。隨機分為假手術組、模型組和阿托伐他汀組，各組又分別設有7 d組和14 d組，每組10只。治療組術前3 d予10 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀生理鹽水混懸液2 ml灌胃，假手術組及模型組予等體積生理鹽水灌胃。分別于術后7 d、14 d處死各組大鼠，取術側腎，常規固定，制片，染色。

1.3.3腎組織形態學檢查 4%中性甲醛固定腎臟組織制成3 μm厚石蠟包埋切片，HE染色后光鏡下觀察腎臟形態學結構，PAS染色和Masson染色觀察腎組織纖維化病變。

1.3.4免疫組化染色 制備好的大鼠腎組織石蠟切片采用兩步法免疫檢測試劑盒進行免疫組化染色，鏡下觀察Wnt4和β-catenin蛋白在大鼠腎組織表達。

1.3.5Western印跡檢測 按組織裂解液說明書步驟提取蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。取相應量的蛋白液和1.5倍SDS配置成統一濃度樣品，混勻后100℃加熱10 min，保存于-20℃備用，使用前煮沸3 min，上樣，轉膜，封閉，孵育一抗過夜，分別為：GSK-3β(1∶500)、p-GSK-3β(1∶600)、Wnt4(1∶200)、β-catenin(1∶300)、α-SMA(1∶200)、E-cadherin(1∶150)、Collagen-1(1∶200)、β-actin(1∶400)，TBST洗膜5 min 3次。孵育特定二抗1 h，洗膜后ECL顯影曝光。檢測各蛋白相對表達量。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1大鼠腎組織病理學改變 HE、PAS染色見假手術組大鼠腎小球、腎小管結構清晰，腎小管排列緊密，腎小管周圍間質無增寬，模型各組大鼠術后7 d起觀察到腎小管管腔擴張，腎小管周圍間質增寬、水腫并伴有大量炎性細胞浸潤，隨梗阻時間延長更加嚴重。但梗阻早期腎小球結構相對完整，阿托伐他汀組較同期模型組上述病變有所改善。Masson染色見假手術組腎小球基底膜、系膜區及腎小管間質無明顯膠原沉積，模型組見增寬的間質充滿著大量藍紫色條索狀膠原，隨梗阻時間延長加重。阿托伐他汀組較同期模型組膠原沉積減少，見圖1。

圖1 HE、PAS和Masson染色觀察各組腎組織14 d形態學改變(×200)

2.2免疫組化學染色結果 假手術組腎組織中未見Wnt4表達，β-catenin蛋白僅少量表達于腎組織中細胞與細胞的連接處，模型組Wnt4高表達于腎小管上皮細胞胞質中，β-catenin蛋白在腎小管上皮細胞和腎小球上皮細胞的胞質中均有表達，阿托伐他汀組Wnt4的表達明顯減少，β-catenin蛋白表達較同期的模型組減少。見圖2。

圖2 Wnt4和β-catenin在各組腎組織表達(DAB，×400)

2.3Wnt4和β-catenin蛋白在大鼠腎皮質的表達 Wnt4和β-catenin蛋白在假手術組大鼠腎皮質的表達極少，UUO成模7 d后，Wnt4和β-catenin蛋白表達開始增多(P<0.05)，成模14 d表達進一步增高，明顯高于同時間點假手術組(P<0.05)； 阿托伐他汀組7 d時Wnt4和β-catenin 蛋白表達與同期模型組無明顯變化(P>0.05)，阿托伐他汀組14 d時，Wnt4、β-catenin蛋白表達較同期模型組顯著減少(P<0.05)。見圖3，表1。

1～5：假手術組、模型組7 d、阿托伐他汀組7 d、模型組14 d、阿托伐他汀組14 d，下圖同圖3 Wnt4和β-catenin蛋白在各組大鼠腎皮質的相對表達

2.4GSK-3β和p-GSK-3β蛋白質大鼠腎皮質的表達 GSK-3β蛋白在各組大鼠腎皮質的表達無統計學差異(P>0.05)，p-GSK-3β蛋白在假手術組大鼠腎皮質中無表達，與假手術組相比，模型組7 d時p-GSK-3β蛋白表達顯著增多(P<0.01)，14 d時p-GSK-3β蛋白仍維持在高于假手術組(P<0.01)；與同期模型組相比，在阿托伐他汀組7 d時p-GSK-3β蛋白表達明顯減少，14 d時p-GSK-3β蛋白的表達較同時點模型組減少更顯著(P<0.05)。見圖4，表1。

圖4 p-GSK-3β/GSK-3β蛋白在各組大鼠腎皮質表達

2.5E-cadherin、α-SMA和CollagenⅠ蛋白在腎皮質的表達 假手術組大鼠腎皮質E-cadherin蛋白呈高表達，α-SMA、Collagen Ⅰ蛋白無表達，與假手術組相比，UUO成模7 d時，E-cadherin蛋白表達顯著減少(P<0.01)，α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達顯著增多(P<0.01)，UUO 14 d時α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達進一步增多(P<0.01)；與模型組7 d相比，給予阿托伐他汀治療7 d后E-cadherin蛋白的表達有所增多，α-SMA和CollagenⅠ蛋白的表達有所下降，但均不顯著，治療14 d后與同期模型組相比E-cadherin蛋白的表達明顯多(P<0.05)，α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達水平明顯減少(P<0.05)。見表1，圖5。

表1 阿托伐他汀對單側輸尿管梗阻大鼠Wnt4及相關蛋白表達影響

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組7 d比較：3)P<0.05；與模型組14 d比較：4)P<0.05

圖5 E-cadherin、α-SMA和CollagenⅠ蛋白在各組大鼠腎皮質的表達

3 討 論

腎小管間質纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎病的主要病理基礎與共同通路，涉及機制十分復雜，目前尚未充分闡明。研究認為EMT是腎小管間質纖維化的重要機制，在各種刺激因素的作用下，細胞外基質(ECM)代謝失調及間質細胞的增殖凋亡失衡是腎小管間質纖維化的重要原因〔7〕，故抑制EMT的發生和減少ECM的沉積對延緩慢性腎病纖維化的發生發展至關重要。 EMT作為腎小管間質纖維化的重要機制，其發生發展受多種細胞因子、生長因子及信號通路的共同調節。近年研究發現，Wnt/β-catenin信號通路在促進腎小管間質纖維化EMT的發生發展中發揮重要的作用〔8〕。β-catenin為經典Wnt/β-catenin信號通路的核心分子，在沒有Wnt 信號作用時，β-catenin能被胞質內中由GSK-3β、結腸腺瘤性息肉蛋白(APC)、軸蛋白(Axin)等構成的破壞復合體中的GSK3β磷酸化，磷酸化后的β-catenin可被E3泛素連接酶識別進而被蛋白酶體泛素化降解，從而使胞內游離的β-catenin處于相對較低的水平，阻止了Wnt信號的傳導；在有Wnt信號時，Wnt 信號傳入胞內與細胞表面受體Frizzled和共受體 LRP5/6 結合，使胞質中的Dsh發生活化，經過一系列的信號傳遞使β-catenin的破壞復合體中有活性的GSK-3β發生磷酸化生成無活性的p-GSK-3β蛋白，p-GSK-3β不能使β-catenin蛋白發生磷酸化，逃脫磷酸化的β-catenin蛋白在胞質中不斷積累，到一定量后發生核轉移與核轉錄因子T細胞因子淋巴增強因子(TCF/LEF)相結合，調節Wnt/β-catenin信號通路下游致纖維效應靶基因的表達〔9〕，促進UUO大鼠腎臟EMT的發生和腎間質ECM的沉積。

阿托伐他汀是細胞內膽固醇合成關鍵酶羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，能抑制細胞內膽固醇的合成，同時還通過受體途徑促進肝臟對低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的攝取，使血膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平降低，因而被廣泛用于動脈粥樣硬化和冠心病等血管疾病的防治中。近年研究發現，他汀類藥物不僅具有降脂的作用，同時還具有抗氧化、抗炎腎臟保護作用等非降脂途徑作用。彭紅霞等〔10〕在UUO模型研究中發現，阿托伐他汀可能通過減少PI3K/AKT信號通路的活化，減輕轉化生長因子(TGF)-β1致纖維化效應，改善腎臟纖維化病變。Wnt/β-catenin信號通路的激活在UUO大鼠腎纖維化發生發展中起到了重要作用,阿托伐他汀通過多種途徑抑制肺、心肌等纖維化發生也有相關報道〔11,12〕，但阿托伐他汀是否可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活，發揮其抗腎纖維化作用目前未見相關報道。

本研究表明阿托伐他汀可以下調Wnt4蛋白的表達，從而減少或阻止了Wnt信號從胞外傳導至胞質中，故GSK-3β不發生磷酸化，未磷酸化的GSK-3β對β-catenin蛋白有磷酸化作用，磷酸化的β-catenin蛋白可被E-3泛素連接酶識別并被泛素化降解，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路傳導，抑制下游致纖維化效應靶基因的表達，延緩了UUO 腎臟EMT的發生和ECM的沉積，改善腎臟纖維化病變，阿托伐他汀抗UUO大鼠腎纖維化病變可能與其抑制Wnt4/β-catenin信號通路的激活和傳導有關。

1Duan J,Gherghe C,Liu D,etal.Wnt1/beta catenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair〔J〕.EMBO J，2012;31(2):429-42.

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3蘇金玲，姜希娟，郭茂娟，等.β連環蛋白在大鼠酒精性肝纖維化中的表達及意義〔J〕.中國老年病學雜志,2013;33(13):3097-8.

4Di Rocco DP,Kobayashi A,Taketo MM,etal.Wnt4/β-catenin signaling in medullary kidney myofibroblasts〔J〕.JASN,2013;24(9):1399-412.

5Yang B,Hodgkinson AD,Shaw A,etal.Protective effect of statin therapy on connective tissue growth factor induction by diabetes in vivo and high glucose in vitro〔J〕.Growth Factors,2013;31(6):199-208.

6薛 痕,樊均明,陳 亮，等.大鼠腎間質纖維化動物模型的實驗研究〔J〕.四川動物,2004;23(1):16-21.

7Tan RJ,Zhou D,Zhou L,etal.Wnt/b-catenin signaling and kidney fibrosis〔J〕.Kidney Int Suppl,2014;4(1):84-90.

8Kim MK,Maeng YI,Sung WJ,etal.The differential expression of TGF-β1,ILK and wnt signaling inducing epithelial to mesenchymal transition in human renal fibrogenesis:an immunohistochemical study〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2013;6(9):1747-58.

9Xiao L,Wang M,Yang S,etal.A Glimpse of the pathogenetic mechanisms of Wnt/β-Catenin signaling in diabetic nephropathy〔J〕.Biol Med Res Int,2013;2013：1-7.

10彭紅霞,陳 明,張 超，等.Akt信號蛋白在阿托伐他汀作用于UUO大鼠腎小管-間質中的表達〔J〕.中國病理生理雜志,2008;24(6):1231-3.

11魏路清,劉 斌,李振華，等.阿托伐他汀對肺纖維化大鼠MMP-9/TIMP-1表達的影響〔J〕.基礎醫學與臨床,2011;31(1):91-2.

12李瑞芳,方偉進,曹珊珊，等.阿托伐他汀對心肌纖維化影響的實驗研究及其作用機制〔J〕.中國臨床藥理學雜志,2014;7(30):594-7.