γ-干擾素對大鼠腎成纖維細胞增殖及單核細胞趨化蛋白-1表達的影響

羅 軍 袁紅伶 徐 劍 呂 琴

(昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032)

腎間質(zhì)纖維化是多種病因引起的腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同病理過程，其主要特點為腎小管擴張或萎縮、間質(zhì)區(qū)大量炎癥細胞的浸潤、細胞外基質(zhì)(ECM)生成降解失衡及組織微血管損傷等。單核細胞趨化蛋白(MCP)-1可使炎癥因子向腎間質(zhì)聚集，導(dǎo)致局部微炎癥的發(fā)生，從而加重腎間質(zhì)纖維化，抑制炎癥因子的釋放與表達能有效緩解腎間質(zhì)纖維化的進程。本研究觀察不同濃度干擾素(IFN)-γ對大鼠腎成纖維細胞(NRK-49F)增殖及MCP-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 NRK-49F細胞株(ATCC)購于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，IFN-γ購于上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司，NRK-49F細胞培養(yǎng)試劑與RT-PCR試劑盒購于云南杰美科技有限公司，兔抗鼠MCP-1抗體與兔抗鼠β-actin一抗購于美國Abcam公司，十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗及蛋白Marker購于北京鼎國公司。

1.2儀器 Forma3111型CO2細胞培養(yǎng)箱(Forma scientific公司)、基因擴增儀GeneAmp PCR System 9700(上海宏潤醫(yī)療設(shè)備有限公司)、NanoDrop 2000超微量分光光度計(賽默飛世爾科技)、Sigma 960酶標(biāo)儀(Metertech公司)、BG-Power 600i百晶電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)、ChemidocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1NRK-49F細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃條件下在細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基根據(jù)細胞種類采用含12%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液。細胞以1×106/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，傳代如常。

1.3.2不同終濃度的 IFN-γ對NRK-49F細胞進行干預(yù) 將細胞接種于96 孔板，次日細胞貼壁后，換為含12%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，逐孔加入不同濃度的IFN-γ，使其終濃度分別為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml，加入等劑量0.9%的生理鹽水作為對照，每組IFN-γ濃度設(shè)定5個復(fù)孔，另外1個不加細胞只加等量的培養(yǎng)基作為調(diào)零孔，共31孔。分別培養(yǎng)12 h、24 h 及36 h 后，在每孔中加10 ml四甲基偶氮唑藍(MTT，5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入 100 ml三聯(lián)裂解液，振蕩15 min，用酶標(biāo)儀以570 nm波長比色，記錄光密度(OD)值。

1.3.3RT-PCR檢測MCP-1 mRNA表達 將細胞接種于6孔板，次日細胞貼壁后，換為含12%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，逐孔加入終濃度為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml的IFN-γ，加入等劑量0.9%的生理鹽水作為對照。Trizol法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，分別進行MCP-1及GADPH擴增。MCP-1引物序列設(shè)計根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫中mRNA序列，利用引物設(shè)計軟件Primer5.0進行設(shè)計，采用GADPH作為內(nèi)參，引物均由上海生工合成，MCP-1引物上游序列：5′-CAA TGA GTC GGC TGG AGA-3′，下游序列：5′-GCT TGA GGT GGT TGT GGA-3′，擴增片段242 bp；GADPH引物上游序列：5′-TAG CCC AGG ATG CCC TTT ATT-3′，下游序列：5′-CCC CCA ATG TAT CCG TTG TG-3′，擴增片段195 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為：42℃ 60 min；70℃ 5 min，共1個循環(huán)；PCR擴增體系為10 μl，MCP-1：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s共35個循環(huán)，之后72℃延伸10 min，最后4℃無窮；GADPH：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s共35個循環(huán)，之后72℃延伸10 min，最后4℃無窮。取5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物，采用2%瓊脂糖凝膠，于80 V恒壓電泳30 min，在化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，采集圖片并分析數(shù)據(jù)。

1.3.4Western印跡檢測MCP-1蛋白表達 常規(guī)培養(yǎng)6孔板細胞長至 85%～95%時，加入1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml的IFN-γ 200 μl干預(yù)24 h，另外設(shè)置一個加入等劑量的0.9%生理鹽水作為對照組。蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，分別等量點樣于10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜，封閉，將一抗MCP-1(1∶10 000)，β-actin(1∶10 000)置于4℃過夜，洗膜，二抗(1∶10 000)孵育，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光，X線顯影定影。Quatity One軟件進行灰度分析

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1IFN-γ對NRK-49F細胞增殖的影響 隨著誘導(dǎo)時間延長，NRK-49F活細胞數(shù)目逐漸增多，即促進能力越強(P<0.05)，但IFN-γ對NRK-49F細胞的促進作用與其濃度無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 IFN-γ對NRK-49F細胞增殖的影響值)

與同時點對照組比較：1)P<0.05；與同濃度IFN-γ前一時點比較：2)P<0.05；下表同

2.2IFN-γ對NRK-49F細胞MCP-1 mRNA表達的影響 IFN-γ可上調(diào)NRK-49F細胞MCP-1 mRNA表達水平，且呈時間依賴關(guān)系(P<0.05)，但與濃度相關(guān)性不大(P>0.05)。見圖1，表2。

1～6:對照組、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml組，下圖同圖1 各組NRK-49F細胞MCP-1 mRNA表達水平

2.3IFN-γ對NRK-49F細胞MCP-1蛋白表達的影響 與對照組(1.454±0.447)相比，1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml IFN-γ能促進NRK-49F細胞表達MCP-1蛋白(1.383±0.528、1.679±0.764、0.742±0.107、1.427±0.079、0.607±0.094，P<0.05)，但和IFN-γ濃度無關(guān)(P>0.05)。見圖2。

表2 IFN-γ對NRK-49F細胞MCP-1 mRNA表達影響

圖2 各組NRK-49F細胞MCP-1蛋白表達

3 討 論

IFN-γ是致炎作用很強的細胞因子，在機體炎癥反應(yīng)過程(包括遲發(fā)超敏反應(yīng)、炎癥、排斥反應(yīng)等)中起著非常重要的作用〔1〕。C-jun氨基末端激酶(JNK)信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)中重要的通路之一，主要影響細胞凋亡、炎癥及腫瘤等病理形態(tài)〔2〕。JNK信號通路的活化是通過其氨基末端殘基磷酸化來實現(xiàn)的，激活之前分布于細胞質(zhì)中，一旦被激活，細胞質(zhì)中的JNK會迅速轉(zhuǎn)移到細胞核中，增強轉(zhuǎn)錄因子蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進凋亡蛋白(AP)-1的表達〔3〕。研究表明IFN-γ主要通過激活JNK信號通路，活化的JNK進入細胞核，使轉(zhuǎn)錄因子AP-1蛋白活性增強，促使DNA表達MCP-1，MCP-1又會介導(dǎo)炎癥因子的聚集，從而加快了炎癥的進展〔4，5〕。MCP-1是一種重要的特異性細胞趨化因子，具有趨化單核細胞和巨噬細胞的功能，在臟器纖維化的過程中具有重要作用〔6〕。在腎間質(zhì)纖維化進程中，MCP-1主要趨化巨噬細胞浸潤腎間質(zhì)，在ECM的合成與分泌發(fā)揮重要作用〔7〕。抑制MCP-1的表達可阻止腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤，改善腎間質(zhì)局部微環(huán)境，減少ECM的合成，從而改善和延緩腎間質(zhì)纖維化的進程〔8〕。本研究結(jié)果顯示IFN-γ對NRK-49F細胞的增殖具有促進作用，這與劉海林等〔9，10〕結(jié)果類似。出現(xiàn)這一與實驗預(yù)期相反的結(jié)果，研究組初步認為這可能與NRK-49F細胞系本身有關(guān)，NRK-49F細胞系本身為活化的細胞，其表現(xiàn)出活化后的諸多特性，而IFN-γ只能抑制未活化的NRK-49F的增殖，對活化的NRK-49F卻產(chǎn)生相反的作用。

通過進一步實驗證實：不同終濃度的IFN-γ干預(yù)NRK-49F細胞MCP-1的表達較對照組明顯升高，MCP-1在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中表現(xiàn)為正調(diào)控，這表明IFN-γ在體外細胞實驗無抗腎間質(zhì)纖維化的特性。出現(xiàn)這一結(jié)果研究組認為存在以下原因：NRK-49F細胞株本身就是活化的細胞，IFN-γ只能對尚未活化的腎間質(zhì)成纖維細胞起作用，對于已活化的NRK-49F細胞反而其促進增殖作用；IFN-γ本身具有抗腎間質(zhì)纖維化的特性，但在體外單一細胞環(huán)境下，IFN-γ抗腎間質(zhì)纖維化的特性沒有被激發(fā)；NRK-49F細胞在IFN-γ的干預(yù)下，可能引起NRK-49F細胞免疫反應(yīng)，從而活化了NRK-49F細胞，表現(xiàn)諸多促進腎間質(zhì)纖維化的性質(zhì)；IFN-γ根本不具備抗腎間質(zhì)纖維化的特性，而是表現(xiàn)促腎間質(zhì)纖維化的性質(zhì)。體內(nèi)研究與體外細胞實驗存在巨大的差異，IFN-γ在體內(nèi)是否具有抗腎間質(zhì)纖維化的特性，仍需大量的動物實驗與臨床研究來證實。

1Rubio-Perez JM，Morillas-Ruiz JM.A review：inflammatory process in Alzheimer′s disease，role of cytokines〔J〕.Sci World J，2012；(6)：756357.

2Davies C，Tournier C.Exploring the function of the JNK (c-Jun N-terminal kinase) signalling pathway in physiological and pathological processes to design novel therapeutic strategies〔J〕.Biochem Soc Transact，2012；40(1)：85.

3Whitham M，Chan MHS，Pal M，etal.Contraction-induced interleukin-6 gene transcription in skeletal muscle is regulated by c-Jun terminal kinase/activator protein-1〔J〕.J Biol Chem，2012；287(14)：10771-9.

4Zhu X，Liu J，Gao Y，etal.ATP-sensitive potassium channels alleviate postoperative pain through JNK-dependent MCP-1 expression in spinal cord〔J〕.Int J Mol Med，2015；35(5)：1257-65.

5Viedt C，Dechend R，F(xiàn)ei J，etal.MCP-1 induces inflammatory activation of human tubular epithelial cells：involvement of the transcription factors，nuclear factor-κB and activating protein-1〔J〕.J Am Soc Nephrol，2002；13(6)：1534-47.

6Lloyd CM，Minto AW，Dorf ME，etal.RANTES and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) play an important role in the inflammatory phase of crescentic nephritis，but only MCP-1 is involved in crescent formation and interstitial fibrosis〔J〕.J Exp Med，1997；185(7)：1371-80.

7Morii T，F(xiàn)ujita H，Narita T，etal.Association of monocyte chemoattractant protein-1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy〔J〕.J Diab Compl，2003；17(1)：11-5.

8Humphreys BD，Xu F，Sabbisetti V，etal.Chronic epithelial kidney injury molecule-1 expression causes murine kidney fibrosis〔J〕.J Clin Invest，2013；123(9)：4023.

9劉海林，陸漢明，李定國，等.α、γ-干擾素對人成纖維細胞的生長和膠原合成的影響〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，1997；17(3)：226-7.

10劉海林，楊少平，李定國.細胞因子在肝纖維化中的作用〔J〕.中華消化雜志，1994；14(3)：172.