肝癌大鼠肝組織中Treg細胞及TGF-β1表達變化及相關性

房新輝 楊玉秀 王長武 郭軍輝

(河南省人民醫院 鄭州大學人民醫院消化內科,河南 鄭州 450002)

我國是肝癌發病率較高的國家，據相關研究報道〔1〕，在2005年～2007年，我國男性肝癌發病率在所有惡性腫瘤中排名第三，女性肝癌發病率在所有惡性腫瘤中排名第五，且肝癌的病死率極高，因此探究肝癌的相關發病機制和尋找新的治療切入點成為目前醫療工作者研究的重點。腫瘤免疫治療的核心思路就是增強患者的免疫功能，通過自身的免疫系統來治療疾病，但肝癌患者體內的免疫微環境受到較嚴重的破壞，這對肝癌的免疫治療帶來了阻礙〔2,3〕。調節性T細胞(Treg)是一類可以調控體內自身免疫反應的T細胞亞群，其數量的變化和功能的異常均會對免疫功能造成影響，CD4+CD25+Treg細胞是Treg細胞研究較多的一個類型，CD4+CD25+Treg細胞在肝癌患者中表達異常，且對免疫功能有抑制作用〔4,5〕。轉化生長因子-β(TGF-β)是一組能調節細胞生長和分化的因子，能抑制T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖〔6〕。本研究旨在探討肝癌大鼠肝組織中CD4+CD25+Treg細胞及TGF-β1的表達情況及其相關性，以期為肝癌的免疫微環境研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取無特定病原體的Wistar大鼠60只，均為雄性，體重178～216 g，平均(194.6±8.7)g，飼養環境溫度在20℃，濕度58%左右，每天給予12 h光照，分籠喂養，每籠10只，正常喂養10 d。實驗大鼠購于南京君科生物工程有限公司。

1.2實驗儀器和藥品 二乙基亞硝胺(Sigma公司，美國)，單色熒光抗體CD4-FITC、CD25-PE(BD公司，美國)，鏈霉親和素-生物素復合物法(SABC)免疫組化試劑盒、TGF-β1山羊抗鼠一抗、兔抗山羊二抗(北京博奧森生物技術有限公司)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(湖北武漢博士德生物工程有限公司)，胚牛血清(BSA)溶液、淋巴細胞分離液、流式細胞儀(上海優寧維生物科技公司)。

1.3分組方法及動物模型 正常喂養10 d后按隨機數字表法將60只大鼠隨機均分為三組，分別為肝癌組(20只)、生理鹽水對照組(20只)、正常對照組(20只)。其中肝癌組大鼠每周腹腔注射一次100 mg/kg的二乙基亞硝胺，連續注射8次〔7〕；生理鹽水對照組大鼠每周腹腔注射一次100 mg/kg的生理鹽水，連續注射8次；正常對照組正常喂養，不做任何特殊處理。

1.4CD4+CD25+Treg細胞水平測定 在建模結束后將所有大鼠處死，取其部分肝組織，剪碎后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，2 600 r/min離心15 min，取其上層清液。加入3 ml淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心12 min，加入4 ml PBS緩沖液，1 000 r/min離心5 min。取出100 μl肝細胞懸液，滴加單色熒光抗體CD4-FITC、CD25-PE，采用流式細胞儀檢測分析CD4+CD25+Treg細胞水平。

1.5TGF-β1水平測定 采用免疫組化SABC法測定TGF-β1水平，取部分肝組織，進行常規石蠟包埋，將組織標本浸泡在二甲苯中20 min進行脫蠟處理，用無水乙醇沖洗后用蒸餾水沖洗。將切片置于10 mmol/L檸檬酸緩沖液中，用醫用微波爐煮20 min，置于室溫中自然冷卻20 min，PBS沖洗。滴加5%BSA溶液，靜置15 min，將多余的溶液甩掉，滴加50 μl一抗，37℃靜置2 h，蒸餾水沖洗，PBS沖洗，甩干，滴加50 μl二抗，37℃靜置20 min。蒸餾水沖洗，甩干，滴加50 μl SABC溶液，37℃靜置20 min。蒸餾水沖洗，甩干，滴加適量DAB溶液，以鋪滿切片表面為宜，室溫下靜置5 min，后將組織標本浸入蘇木素溶液中復染10 min，置入95%乙醇溶液浸泡5 min，置入無水乙醇浸泡5 min，重復兩次，再放入二甲苯的溶液中，浸泡5 min，滴加少量中性樹膠，封片晾干。采用Mias-2000病理圖分析系統分析，在400倍顯微鏡下觀察，細胞漿或細胞膜為棕黃色則可判定為陽性細胞，采用灰度值來衡量染色強度，灰度值越小代表染色強度越深，提示陽性表達越強，任意取10個區域計算陽性灰度值，最后結果取其平均值。

1.6統計學方法 應用SPSS19.0軟件，計數資料采用χ2檢驗，計量資料，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，采用 Spearman相關性分析。

2 結 果

2.1三組大鼠建模情況 正常對照組大鼠處死前各項生命體征均表現正常，無異常死亡。生理鹽水組大鼠處死前毛發光澤較差，精神狀態較差，運動較少，食欲一般，對外界刺激反應較慢，無異常死亡。肝癌組大鼠處死前毛發雜亂無光澤，精神萎靡，極少運動，食欲不振，對外界刺激反應極慢，5只大鼠異常死亡。

2.2三組大鼠的CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T細胞比例和TGF-β1表達水平對比 三組大鼠的CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T細胞比例和TGF-β1表達水平整體比較差異有統計學意義(P<0.05)；肝癌組大鼠的CD4+CD25+Treg細胞占比顯著高于正常對照組和生理鹽水對照組，TGF-β1灰度值顯著低于正常對照組和生理鹽水對照組(均P<0.05)；生理鹽水組的TGF-β1灰度值顯著低于正常對照組(P<0.05)，但CD4+CD25+Treg細胞占比與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組大鼠的CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T細胞比例和TGF-β1表達水平對比

與正常對照組比較：1)P<0.05；與生理鹽水對照組比較：2)P<0.05

2.3肝癌組大鼠CD4+CD25+Treg細胞和TGF-β1相關性分析 肝癌組大鼠CD4+CD25+Treg細胞和TGF-β1表達水平呈明顯的正相關(r=0.823，P=0.000)。

3 討 論

肝癌可分為繼發性肝癌和原發性肝癌，繼發性肝癌又稱轉移性肝癌，系指全身多個器官起源的惡性腫瘤侵犯、轉移至肝臟。原發性肝癌較為多見，系指惡性腫瘤起源于肝臟的上皮或間葉組織〔8〕。目前原發性肝癌的發病機制尚不明確，其危險因素主要有乙肝病毒感染、肝硬化、家族癌癥史、酗酒、不良的飲食習慣等〔9〕。肝癌患者的免疫微環境主要由肝癌細胞周圍的淋巴細胞、成纖維細胞、免疫細胞、肝星狀細胞等構成，當免疫微環境正常時能對腫瘤細胞形成較大的殺傷力，能逐漸改善患者的各項生命體征，但肝癌患者體內存在較強的免疫微環境抑制，主要是腫瘤細胞為順應其生長和轉移，通過分泌免疫抑制因子來破壞免疫微環境，當免疫微環境受到抑制時腫瘤細胞獲得較好的生長和轉移條件，進而使得病情惡化〔10〕。有研究指出〔11〕，采用肝動脈栓塞化學治療聯合免疫治療能有效地提高患者的免疫功能，降低血清腫瘤相關指標水平，提高生存率，由此可見從免疫微環境切入治療肝癌是值得探索的。

CD4+CD25+Treg細胞是一類主要由胸腺產生的細胞群，主要表達為CD4分子、CD25分子和叉頭蛋白3(Foxp3)。有研究報道〔12〕，將正常小鼠體內的CD4+CD25+Treg去除會導致多種自身免疫性疾病，而將其回輸則可避免免疫性疾病的發生，從而證明該細胞群具備免疫調節能力。CD4+CD25+Treg細胞可抑制自身免疫反應，在正常人體內能通過其免疫抑制調節功能來防止免疫反應擴大和過度免疫反應，從而維持正常的免疫功能，避免發生免疫性疾病，在機體出現微生物感染、過敏反應時CD4+CD25+Treg細胞都可以起到重要的免疫調節作用。有研究表明〔13〕，正常情況CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T細胞比例在5%～10%的范圍內，但在肝癌患者中其占比明顯上升，可能直接或間接促進了腫瘤的發展。本研究說明CD4+CD25+Treg細胞在肝癌大鼠病理組織中呈現高表達，這提示高表達的CD4+CD25+Treg細胞可能會對免疫微環境產生負面的影響，過度抑制免疫反應，導致腫瘤細胞獲得更好的生存條件。CD4+CD25+Treg細胞對免疫反應的抑制機制可有以下幾點〔14〕：①通過分泌白細胞介素(IL)10、TGF-β等因子來對免疫功能進行調節；②通過釋放顆粒酶和穿孔素對效應細胞形成殺傷；③以半乳糖凝集素為媒介與T細胞表面的糖蛋白受體發生反應，從而減少T細胞分泌IL-2 和γ干擾素；④Foxp3和T細胞發生作用，抑制效應T細胞和自然殺傷細胞的活性。本次研究提示TGF-β1在肝癌大鼠肝癌組織中呈現高表達。TGF-β1具有抑制T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖的作用，從而對機體的免疫功能產生抑制，此外，TGF-β1還能誘導Foxp3表達，使得部分CD4+CD25+初始T細胞轉化為CD4+CD25+Treg細胞，進一步增加肝癌中CD4+CD25+Treg細胞水平，而CD4+CD25+Treg細胞又可分泌TGF-β1，進而導致兩者數量相互促進〔15〕。本研究顯示兩者呈正相關也印證了這一點。

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