過表達Runx2基因?qū)ρ浪杓毎只嚓P(guān)基因的影響

唐小雪 周 政 王 洋 高 蕓 李 琦

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔科，新疆 石河子 832008)

牙髓組織具有很強的自我修復能力，當受到外界損傷刺激時發(fā)揮自我更新作用。牙齒受到輕微刺激如磨耗等會促進成牙本質(zhì)細胞生成反應(yīng)性牙本質(zhì)，但受到嚴重的刺激時誘導牙髓周圍的成牙本質(zhì)細胞凋亡〔1，2〕。目前普遍認為，牙髓細胞中未分化的干細胞或者祖細胞可分化形成成牙本質(zhì)細胞，修復損傷部位，形成修復性牙本質(zhì)〔3〕。牙髓細胞由成纖維細胞、分化程度不等的祖細胞等組成。牙髓細胞分化形成成牙本質(zhì)細胞的過程不是由某一種細胞分化形成，而是由不同分化能力的祖細胞群共同形成的〔4〕。既往研究表明，可通過構(gòu)建體外誘導牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化模型，研究牙髓細胞分化機制，為牙齒修復性研究提供更多的理論依據(jù)〔5〕。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2在成骨細胞和成牙本質(zhì)細胞分化、成熟過程中起關(guān)鍵性作用。研究表明，Runx2通過調(diào)控成骨和成牙本質(zhì)細胞分化的相關(guān)基因的表達，參與成骨和成牙本質(zhì)細胞的分化過程〔6〕。本實驗擬研究過表達Runx2基因?qū)Τ裳辣举|(zhì)細胞分化相關(guān)基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料與設(shè)備 高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，購自美國GIBCO公司，堿性磷酸酶(ALP)活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，Runx2抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗均購自美國CST公司，酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，實時定量PCR儀購自美國AB公司，凝膠成像系統(tǒng)購自德國Royal Intas Gel Hood Imager公司。

1.2細胞培養(yǎng)及成牙分化誘導 收集12～15歲因正畸而拔除的健康前磨牙，收集前均已征得患者及家屬的同意。采用無菌眼科鑷取出完整的牙髓組織，經(jīng)酶消化后，置于原代細胞培養(yǎng)基中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d更換1次培養(yǎng)基，使用2.5%胰酶消化貼壁細胞進行傳代，第4代細胞用于后續(xù)實驗。

取第4代牙髓細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到約90%時，培養(yǎng)基更換為礦化誘導培養(yǎng)基(每100 ml誘導培養(yǎng)基含有1 μmol β-磷酸甘油鈉、10-6μmol地塞米松和5 mg抗壞血酸)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集0、7、14 d的各組細胞用于后續(xù)實驗。

1.3測定ALP的活性 提取0、7、14 d細胞中的總蛋白，取15 μl蛋白樣品、100 μl混合液加入96孔板中，輕輕振蕩混勻，37℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，每孔加入150 μl顯色劑，置于酶標儀上測定各孔在520 nm波長的吸光值(OD520 nm)，計算各組ALP的活性。實驗重復3次，每孔4個復孔。

1.4細胞轉(zhuǎn)染 收集牙髓細胞，按2×104個/孔接種到6孔板上，在37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作，將細胞隨機分為2組，陰性對照組中加入pcDNA3.1空載質(zhì)粒，pcDNA3.1-Runx2組中加入pcDNA3.1-Runx2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)基更換為礦化誘導液，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d和14 d進行后續(xù)實驗。

1.5蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western印跡)檢測轉(zhuǎn)染后細胞中Runx2蛋白的表達量 收集轉(zhuǎn)染細胞，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入200 μl細胞蛋白裂解液，置于冰上裂解15 min，提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，95℃加熱5 min。配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，加入電泳液。55 V電泳40 min，調(diào)整電壓至120 V繼續(xù)電泳90 min。將所得蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中封閉1 h，加入適量濃度的一抗，4℃孵育過夜，TBS/T漂洗3次×10 min，加入HRP標記的二抗，37℃孵育1 h，TBS/T漂洗3次×10 min，避光加入電光化學發(fā)光法(ECL)反應(yīng)液，曝光，顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白水平。

1.6實時定量PCR(qRT-PCR)檢測牙髓細胞中分化相關(guān)基因的表達 利用Primer 5.0軟件設(shè)計牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)、骨涎蛋白(BSP)基因的引物序列，DSPP上游序列為5′-CCATTCCCACGGACTCCCA-3′，下游序列為5′-TGGCGATGCAGGTCACAAT-3′；BSP游序列為5′-CAAGCATGCCTACTTTTATCCTC-3′，下游序列為5′-CTTCTTGGGAAGCTGGATTG-3′。轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)礦化誘導液培養(yǎng)后，加入1 ml TRIzol細胞裂解液提取細胞中的總RNA，去除基因組DNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，GAPDH為參照，進行擴增。擴增條件為預變性94℃ 10 min，94℃ 10 s，58℃/60℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算DSPP、BSP mRNA表達水平，實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本差異使用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化過程中ALP活性的變化 牙髓細胞經(jīng)礦化誘導，與0 d〔(1.456±0.068)U/g〕相比，在分化誘導的第7和14天，細胞中ALP的活性顯著升高〔(10.659±1.526)U/g,(21.863±3.568)U/g〕(P<0.05)，且ALP的活性在分化誘導的第14天較第7天顯著升高(P<0.05)，表明牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化模型構(gòu)建成功。

2.2轉(zhuǎn)染過表達載體對細胞中Runx2蛋白表達量的影響 牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化過程中，Runx2的表達量逐漸增加；與陰性對照組相比，在分化誘導的第7和14天，pcDNA3.1-Runx2組細胞中Runx2的含量顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 轉(zhuǎn)染過表達載體對細胞中Runx2蛋白表達量的影響

與陰性對照組相比：1)P<0.05；下表同

1：陰性對照組；2：pcDNA3.1-Runx2組圖1 轉(zhuǎn)染過表達載體對細胞中Runx2蛋白表達量的影響

2.3Runx2過表達對牙髓細胞分化相關(guān)基因水平的影響 牙髓細胞轉(zhuǎn)染后，細胞中DSPP mRNA和BSP mRNA在0 d差異不顯著，在分化誘導的第7和14天，細胞中DSPP mRNA(P<0.05)和BSP mRNA(P<0.05)水平均顯著高于陰性對照組。見表2，表3。

表2 Runx2過表達對牙髓細胞中DSPP mRNA表達的影響

表3 Runx2過表達對牙髓細胞中BSP mRNA表達的影響

3 討 論

牙髓組織可形成牙本質(zhì)，對牙齒的修復、營養(yǎng)、防御具有重要作用。牙髓組織主要由牙髓細胞組成，參與牙齒損傷修復過程。牙髓細胞是一種混合型細胞，在成牙分化過程中起主要作用的是祖細胞群。研究證實，體外誘導成牙分化過程與體內(nèi)成牙本質(zhì)細胞的分化過程極為相似，因此可通過體外構(gòu)建牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化模型，研究成牙分化的相關(guān)機制〔5〕。ALP是反映牙齒礦化的關(guān)鍵性酶，對牙髓細胞的分化過程起重要作用〔7〕。在牙髓細胞分化為成牙本質(zhì)細胞的過程中，ALP的活性逐漸增強〔8〕。研究表明，ALP是重要的早期成牙本質(zhì)細胞分化的相關(guān)標志〔9〕。在本實驗中，ALP在牙髓細胞誘導的過程中活性逐漸升高，與前人研究結(jié)果一致，說明體外誘導牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化模型構(gòu)建成功。

Runx2是Runt基因家族的重要成員之一，在成牙分化和成骨細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。研究報道顯示，在成牙本質(zhì)細胞分化過程中，Runx2的表達量逐漸增加，說明Runx2參與成牙分化的形成過程〔10〕。目前，Runx2在牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化過程中的作用的相關(guān)報道較少。DSPP是一種牙齒發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的機制蛋白〔11〕。研究表明，DSPP可作為成牙本質(zhì)細胞分化過程的重要指標，其表達量一定程度反映牙髓細胞分化能力〔12〕。有文獻報道，Runx2能夠通過促進DSPP基因的表達，從而促進牙髓細胞向成牙分化的過程〔13，14〕。BSP是細胞外基質(zhì)中的磷酸化硫化性糖蛋白，在成骨細胞分化、牙髓細胞礦化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔15-16〕。BSP被認為是成牙本質(zhì)細胞分化過程的標志基因〔17〕。本實驗結(jié)果表明Runx2參與調(diào)控牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞的分化過程。過表達載體進一步增加Runx2的表達量。過表達Runx2基因可增加DSPP、BSP的表達，提示Runx2的表達量增加促進牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞的分化。

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