川芎嗪聯(lián)合腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞分化

蘇立寧 宋小青 朱登祥 魏會平 王 睿

(河北北方學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，河北 張家口 075000)

干細胞誘導和細胞移植技術(shù)的發(fā)展為神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復、再生和功能恢復提供了新的有潛力的治療手段。胚胎干細胞具有定向誘導分化難以控制、供體來源困難、異體排斥反應(yīng)等缺點。神經(jīng)干細胞是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的良好“種子”細胞，但多從胚胎或成熟的中樞系統(tǒng)取材培養(yǎng)，也制約了細胞的來源，如歐洲已明確規(guī)定禁止從人胚胎中獲取干細胞。而骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)〔1〕可以解決上述問題，因此間充質(zhì)干細胞的誘導分化和體內(nèi)移植成為這一領(lǐng)域的研究熱點。已有研究證實BMSCs是治療缺血性腦疾病、帕金森病、脊髓損傷、坐骨神經(jīng)損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細胞，這方面研究可為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療提供較好的理論和實驗依據(jù)〔2～5〕。在合適的誘導條件下，BMSCs可向多種細胞及神經(jīng)樣細胞分化〔1，6～10〕。目前國內(nèi)外對BMSCs分化和神經(jīng)系統(tǒng)修復的研究主要集中在BMSCs體外誘導分化及體內(nèi)移植實驗，關(guān)于BMSCs可定向誘導向神經(jīng)樣細胞分化已經(jīng)取得了不少成果〔11～15〕。川芎嗪對腦損傷的保護及其作用機制成為研究熱點〔16～18〕。有學者還發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以保護缺血性腦損傷、減輕神經(jīng)元凋亡，與促進神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達有關(guān)〔19〕。BDNF高表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其發(fā)育過程中具有調(diào)控神經(jīng)元的存活、分化、生長及保護神經(jīng)元免受損傷，改善神經(jīng)元病理狀態(tài)等作用，是成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持生存及正常生理功能所必需〔20～22〕。本研究觀察川芎嗪聯(lián)合BDNF誘導 BMSCs 向神經(jīng)樣細胞分化。

1 材料和方法

1.1材料 健康SD大鼠4只，4周齡，體質(zhì)量(90±20)g，由中國醫(yī)學科學院實驗動物繁殖中心提供。DMEM/F12(GIBCO公司)、BDNF(GenScript公司)、RNA提取試劑盒、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)引物(TaKaRa公司)、兔抗巢蛋白(nestin)、兔抗NSE(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、川芎嗪(成都植標化純生物技術(shù)有限公司)。

1.2BMSCs的分離及培養(yǎng) 原代培養(yǎng)：無菌條件下取SD大鼠股骨和脛骨，采用D-Hanks液多次沖洗多余血液，采用含1%的雙抗(青、鏈霉素)+10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，得到細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次半換液，以后每2天換液一次。傳代培養(yǎng)：待細胞密度達到80%～90%時，0.25%的胰酶消化進行傳代。通過傳代，細胞逐漸純化，至第3代后，細胞純度較高。細胞培養(yǎng)過程中，使用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，并拍照記錄。

1.3BMSCs表面標志的檢測 取第3代大鼠BMSCs與熒光標記的抗鼠CD29，CD34，CD45，CD90混合，37℃作用30 min后，經(jīng)流式細胞儀檢測細胞純度。

1.4BDNF和川芎嗪聯(lián)合誘導BMSCs的分化 取第3代BMSCs，胰酶消化后按 3×105/ml濃度接種于放置有蓋玻片的6孔板內(nèi)，制備細胞爬片分為4組進行誘導。對照組：不加任何誘導劑；BDNF組：加入100 ng/ml BDNF；川芎嗪組：加入1.25 mg/ml川芎嗪；BDNF聯(lián)合川芎嗪組前2 d加100 ng/ml BDNF，后2 d加1.25 mg/ml川芎嗪。每個實驗組均誘導4 d。

1.5免疫細胞化學方法鑒定BMSCs的分化 每個實驗組采用免疫細胞化學方法觀察nestin、NSE的表達，顯微鏡下觀察結(jié)果，并拍照。免疫細胞化學方法如下：取出細胞爬片，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次，冷丙酮固定10 min，PBS洗3次，每次3 min；將蓋玻片浸入3%H2O2中，室溫孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min；用試劑A(正常山羊血清)封閉20 min，吸棄，不予漂洗；分別滴加稀釋后的Nestin、NSE抗體(1∶200稀釋度)置入濕盒中4℃過夜，PBS漂洗3次，每次3 min；加入試劑B(生物素標記的二抗)，37℃孵育15～20 min，PBS漂洗3次，每次3 min；滴入試劑C，室溫或37℃孵育15～20 min，PBS漂洗3次，每次3 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色10 min，自來水沖洗終止反應(yīng)，中性樹膠封片。

1.6實時熒光定量PCR檢測誘導前后NSE mRNA表達 根據(jù)GenBank公布的基因序列設(shè)計引物，由上海生工合成。NSE引物正義鏈：GTATGGATGTGGCTGCCTCTG，反義鏈：TCCTGGTCGAATGGGTCTTC。采用 SYBR Green Ⅰ熒光染料法進行實時定量 RT-PCR 擴增的檢測。PCR反應(yīng)體系為20 μl，置于實時熒光定量PCR儀中擴增，反應(yīng)條件為：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，72℃檢測信號。

1.7統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1誘導前大鼠BMSCs細胞的形態(tài)觀察 原代培養(yǎng)2 d后倒置顯微鏡觀察，細胞少量呈群落生長，形態(tài)大多呈短梭形；4～6 d細胞形態(tài)大多呈長梭形或呈多邊形，細胞集落不斷擴大，呈群落生長。胰酶消化傳代，二代、三代細胞生長較穩(wěn)定，密度較均勻，形態(tài)以長梭形為主，符合BMSCs的細胞形態(tài)特征(圖1)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：CD29，CD90表達陽性，陽性率分別為99.8%，88.6%；CD34，CD45表達陰性，陽性率分別為1.8%，23.3%。

2.2加入誘導劑后BMSCs的形態(tài)學變化 處理4 d后，對照組細胞形態(tài)沒有任何變化；BDNF聯(lián)合川芎嗪，4 d后出現(xiàn)較多神經(jīng)樣細胞，細胞體積增大，胞核固縮，核質(zhì)比降低，細長突起明顯，部分細胞間以網(wǎng)絡(luò)狀連接；而BDNF組和BDNF聯(lián)合川芎嗪組可見到少量神經(jīng)樣細胞(圖2)。

圖1 誘導前大鼠BMSCs形態(tài)(倒置相差顯微鏡，×100)

圖2 BMSCs形態(tài)學變化(×100)

2.3BMSCs分化的鑒定 免疫細胞化學方法檢測結(jié)果顯示誘導4 d后，對照組細胞nestin和NSE標記陰性，BDNF聯(lián)合川芎嗪組nestin和NSE標記陽性(圖3)。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，對照組為0.615±0.006，BDNF組0.719±0.006，川芎嗪組為0.727±0.005，BDNF聯(lián)合川芎嗪組為1.586±0.003。BDNF聯(lián)合川芎嗪組細胞的NSE 基因表達量顯著高于對照組、BDNF組及川芎嗪組。

圖3 BMSCs分化鑒定結(jié)果

3 討 論

BMSCs是骨髓微環(huán)境的重要組成部分，在體內(nèi)分布于多種組織器官，體外在特定的誘導條件下可分化為各種細胞，其中包括神經(jīng)樣細胞。目前，BMSCs具有自我更新和多向分化潛能的特性已經(jīng)被廣泛認知。一些學者用 β-巰基乙醇〔23〕、二甲基亞砜、4-羥基茴香烷〔24〕、丁基化酚酮等化學試劑，體外成功誘導BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化，但由于化學試劑的毒性作用，很難應(yīng)用于臨床治療。近年研究表明使用丹參、多糖、黃芪類、紅景天苷、銀杏內(nèi)酯、鹿茸多肽和白藜蘆醇等藥或其提取物可誘導 BMSCs 向神經(jīng)樣細胞分化，并表達多種神經(jīng)干細胞或神經(jīng)細胞的特異性標志物〔25～32〕。藥理學的研究認為，上述藥物的誘導作用可能和藥物的抗氧化作用有關(guān)。川芎嗪是一種已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)科和心血管內(nèi)科等領(lǐng)域的傳統(tǒng)中藥提取物，其提取物藥理作用較廣泛，具有抗氧化、清除氧自由基、保護神經(jīng)細胞等作用，因此川芎嗪具有誘導BMSCs 定向分化為神經(jīng)樣細胞的潛能。細胞的分化還受各種細胞因子的影響，其中神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用尤為關(guān)鍵。BDNF參與調(diào)控神經(jīng)結(jié)構(gòu)及功能變化，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的學習和長期記憶中發(fā)揮重要作用，分泌后與其受體酪氨酸激酶受體B結(jié)合產(chǎn)生一系列信號途徑，保護神經(jīng)元、促進損傷神經(jīng)再生〔31，33，34〕。Lim等〔35〕將BDNF添加入神經(jīng)誘導培養(yǎng)基，成功誘導BMSCs向神經(jīng)分化，分化過程與MAPK/ERK和PI3K/Akt信號有關(guān)。Han等〔36，37〕在體外將BDNF基因轉(zhuǎn)入BMSCs，與普通的BMSCs相比，BDNF/BMSCs表現(xiàn)出更高的增殖能力，分泌更多的BDNF，明顯提高向神經(jīng)樣細胞分化的比率。BDNF在腦內(nèi)表達量尤為顯著，對發(fā)育中中樞神經(jīng)的存活、分化及增殖具有促進作用，防止神經(jīng)元退行性變，還能抗細胞凋亡。本實驗中，BDNF聯(lián)合川芎嗪組神經(jīng)樣細胞的存活時間明顯比川芎嗪單體誘導組要長，可能與上述機制有關(guān)，BDNF延長了神經(jīng)樣細胞的存活時間。微小RNA(miRNA)是具有調(diào)控功能的非編碼RNA，大小20～25個核苷酸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。近年來，對于miRNA在神經(jīng)細胞分化中所起作用的研究成為神經(jīng)誘導中的研究熱點之一，最近有研究發(fā)現(xiàn)在亨廷頓舞蹈病患者體內(nèi)，神經(jīng)功能紊亂和死亡均會導致miR-10b-5p表達量上升，其靶基因BDNF表達量降低，BDNF與miR-10b-5p共同調(diào)控神經(jīng)的功能及存活〔38〕，從另一方面為尋找BMSCs向神經(jīng)細胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子提供基礎(chǔ)。綜上所述，BDNF在神經(jīng)細胞分化中發(fā)揮了重要作用，是神經(jīng)分化及生長不可缺少的因子。

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