補腎祛痰法對膝骨性關節炎模型大鼠血清及關節液中炎癥因子的影響

鄭煒宏 唐劍邦 高大偉 吳宇峰 何君源 黃子奇

(中山市中醫院骨三科，廣東 中山 528400)

膝骨性關節炎(OA)是一種由多因素導致的慢性退行性膝關節疾病，其主要病理特征是膝關節軟骨破壞、丟失及硬化等，甚至出現囊性病變并形成骨贅，導致關節腫脹、劇痛，其病變范圍還包括關節周圍骨骼、肌肉、韌帶和滑膜，關節功能出現進行性功能障礙。OA在人群中的發病率非常高，尤其在老年人群中其發病率已經超過37%〔1〕。既往OA的治療以鎮痛為主，治療帶來的胃腸道副作用較大〔2〕。OA在中醫學上屬于“痹病”范圍，主要病因是肝腎虧虛、筋骨失養、外邪痹阻，有痰、瘀之表現，現代生理學發現關節滑液可以潤滑和營養關節腔，而中醫理論認為津液化而為痰，推斷關節液與痰存在一定聯系〔3〕。本次研究采用補腎祛痰方治療大鼠OA模型，并分析其對大鼠血清及關節液炎癥因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康SD大鼠32只(由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供)，體重180～220 g。大鼠采用標準飼料進行科學無菌喂養，飲水自由。

1.2藥物制備 本研究采用補腎祛痰方進行治療，主要藥物包括陳皮15 g、骨碎補15 g、續斷15 g、熟地黃15 g、杜仲15 g、川芎10 g、蒼術10 g、川牛膝10 g、法半夏10 g、甘草5 g。藥物均用水煎服，由院內中藥制劑室提供。

1.3方法

1.3.1分組與造模 OA模型建立采用改良的Hulth法〔4〕，10%水合氯醛溶液，注射劑量為0.33 ml/100 g。手術造模過程需要嚴格堅持無菌操作，手術采用膝關節內側縱切口，檢查關節腔內無原發病變，隨后將大鼠膝關節前后交叉韌帶、內側副韌帶、內側半月板切斷，手術過程中切勿損傷關節軟骨，進行抽屜試驗陽性后徹底止血，關節腔止血，并將少量青霉素溶液注入關節腔內，逐層縫合關節囊及皮膚，患處采用無菌敷料包扎，并不進行固定。大鼠行膝骨關節術后每日用青霉素40×104U肌肉注射，無菌敷料進行換藥，預防出現感染等并發癥。依據以往經驗，超疲勞活動能夠使得OA提前發病〔5〕。因此，大鼠手術后1 w進行每日30 min強迫活動，持續4 w后則可以得到穩定OA模型。造模成功后，按照隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組、中藥組及西藥組，每組8只，對照組大鼠則僅將膝關節切開，韌帶并不切斷。

1.3.2治療方法 大鼠在完成造模后第4周進行藥物治療，主要采用灌胃給藥。中藥組采用補腎祛痰法中藥制劑灌服，模型組及對照組大鼠灌服等量生理鹽水，西藥組大鼠則采用美洛昔康0.45 mg/kg灌服。藥物灌服治療每日1次，持續治療4 w〔6〕。

1.4觀察指標 ①基本情況觀察：主要觀察指標包括大鼠毛發光澤程度、進食量、體重變化、精神狀態及活動量情況；②血液、關節液炎癥因子測定：實驗結束后腹腔取血4 ml，置于涂有肝素鈉的采血管中，3 500 r/min，離心10 min，吸取上清液即得血漿。另外抽取關節積液2 ml，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測白細胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α〔7〕；③步態的評價〔8〕：實驗大鼠在藥物治療8 w后觀察每日步態，步態狀況參考Coderre法進行分級〔8〕，共4級：0級：實驗大鼠能夠正常行走；Ⅰ級：大鼠出現輕度的跛行，膝關節以下略彎曲；Ⅱ級：大鼠出現中度跛行，患肢僅能觸到地面；Ⅲ級：大鼠重度跛行，患肢略微離開地面，其余3足著地行走；④膝關節周長測量：在最后一次灌服藥物后30 min，麻醉各組大鼠，膝關節周長采用軟尺進行測量，手術膝關節與正常膝關節進行對比，計算腫脹率〔9〕，腫脹率(%)=(手術膝關節周長-正常膝關節周長)/正常膝關節周長×100%。

1.5統計學方法 應用SPSS20.0軟件，計量數據采用t檢驗，多組間比較采用獨立樣本方差分析；計數資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1大鼠基本情況 對照組大鼠毛發光亮，進食正常，體重和精神狀態、活動量無變化；模型組大鼠毛發暗淡，進食量和體重下降，活動量下降；中藥組和西藥組大鼠毛發光亮度一般，進食量逐漸恢復正常，活動量逐漸恢復。

2.2步態的評價 實驗大鼠在藥物治療后第8周觀察步態，對照組大鼠表現正常，0級8只；模型組大鼠跛行嚴重，Ⅲ級7只，Ⅱ級1只；中藥組和西藥組大鼠步態均出現不同程度改善，中藥組0級2例，Ⅰ級5例，Ⅱ級1例；西藥組0級1例，Ⅰ級4例，Ⅱ級2例，Ⅲ級1例。

2.3膝關節周長對比 對照組大鼠膝關節周長處在正常范圍內，模型組大鼠膝關節周長顯著高于中藥組、西藥組和對照組(P<0.05)，中藥組、西藥組與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，中藥組、西藥組、模型組大鼠腫脹率高于對照組(P<0.05)，中藥組、西藥組大鼠腫脹率低于模型組(P<0.05)，中藥組和西藥組大鼠的膝關節周長和腫脹率差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 補腎祛痰法治療膝關節炎大鼠膝周長的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

2.4血清及關節液炎性因子水平對比 與對照組相比，中藥組、西藥組、模型組大鼠血清及關節液內IL-1、IL-6及TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；中藥組和西藥組大鼠血清及關節液內IL-1、IL-6及TNF-α水平低于模型組(P<0.05)；中藥組與西藥組各項指標對比無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 補腎祛痰法治療OA大鼠血清和關節液炎性因子的影響

3 討 論

現代醫學認為膝OA是一種慢性退行性關節病變，主要涉及膝關節軟骨、軟骨下骨質并形成關節軟骨的骨贅，其發病機制尚未完全明確。關節軟骨主要是由軟骨細胞、基質兩部分組成，致病因素主要是對這二者進行影響，從而導致病情出現。病理學研究表明〔10〕，IL-1主要是干擾關節軟骨細胞代謝，促使關節軟骨降解。TNF-α與IL-1協同作用，同時還能夠誘導生成IL-6，在OA等疾病的發生、發展過程中起著重要作用。相關研究表明〔11〕，在關節腔內IL-1、IL-6及TNF-α表達水平增加，且因子水平與炎癥嚴重程度存在正相關關系，可以作為疾病程度的參考指標。在傳統中醫學說中，膝OA均屬于“痹證”范疇，經典中醫理論認為膝OA與患者勞損、體衰、風寒、濕邪存在密切關系，具體表現為肝腎虧虛、痰瘀互結，腎虛與血瘀二者相互作用，在疾病進展過程中始終發揮重要作用，最終成痹。而關節腔內含關節液，發揮潤滑作用，中醫認為關節液屬“津液”，津液在病理狀態下代謝則成為痰，因而中醫理論認為〔12〕關節積液和痰之間存在聯系。本質為氣虛陽虛，多痰、多濕則是表象。膝OA患者缺少運動鍛煉，導致肥胖提醒居多，脾失健運，使得肝腎兩虛，水無歸源，留則顯濕，發而生痰，痰隨氣升，連通腹臟，進而侵及筋骨關節。痰濕淤積，氣血不暢。因此，本研究采用中醫補腎祛痰法進行治療，藥方內主要藥物成分中，蒼術、陳皮、半夏等具有化痰除濕的功效，杜仲、熟地黃、牛膝、續斷等藥物則發揮強筋健骨、益氣補腎等作用，川芎則具有止痛活血的功能，兼有除濕行氣的效用，而甘草則能調節各藥性能，使其各自發揮作用，共同具備補腎祛痰的效果〔13〕。

本次動物實驗表明補腎祛痰法藥劑能夠有效抑制關節軟骨退變，緩解滑膜炎癥。OA作為一種關節退行性病變，發病過程與腎具有緊密聯系，補腎是治療OA的關鍵療法，腎氣足則表明機體骨骼健壯，組方中的杜仲、熟地黃、牛膝、續斷能夠強健筋骨，補益腎臟；此外有學者認為血瘀是OA發病的病因之一，腎是先天之本，腎虧則容易導致血流不暢，在關節中形成阻滯，導致關節失去營養支持，同時還會造成風濕痹痛，組方中川芎發揮止痛活血的功效；另外OA患者的致病原因還有濕熱和痰瘀，外濕在關節處積聚成痰，侵襲關節和經絡，使得關節腫痛和變形等，方中的蒼術、陳皮、半夏主要起化痰除濕的作用〔14〕。除此之外，現代藥理學研究分析其作用機制是補腎祛痰藥劑中的有效成分能夠抑制釋放軟骨細胞、滑膜內炎性因子，使得軟骨細胞代償能力有效提高，軟骨細胞周圍代謝環境改善，在一定程度上緩解軟骨退變〔15〕。補腎祛痰法藥劑能夠發揮西藥同等效果。

綜上所述，補腎祛痰法能夠有效改善OA大鼠跛行狀況，能夠消除腫脹膝關節，更重要的是補腎祛痰法藥劑能夠有效抑制膝骨性關節炎細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α水平，減輕炎性癥狀，其臨床作用需要進一步進行訓練。

1唐劍邦,吳宇峰,高大偉,等.透明質酸鈉注射結合補腎祛痰方治療肥胖患者膝骨關節炎的臨床研究〔J〕.廣州中醫藥大學學報,2016;33(4):465-8.

2Kelly S,Chapman RJ,Woodhams S,etal.Increased function of pronociceptive TRPV1 at the level of the joint in a rat model of osteoarthritis pain〔J〕.Ann Rheum Dis,2015;74(1):252-9.

3趙 婧,闞衛兵,宋朋飛,等.祛痰化瘀利濕法治療骨性關節炎的研究進展〔J〕.廣西中醫藥大學學報,2013;16(3):77-9.

4Loffredo FS,Pancoast JR,Cai L,etal.Targeted delivery to cartilage is critical for in vivo efficacy of insulin-like growth factor 1 in a rat model of osteoarthritis〔J〕.Arthritis Rheumatol,2014;66(5):1247-55.

5李艷彥,趙 樂,王永輝,等.黃芪桂枝五物湯對陽虛寒凝型骨關節炎大鼠免疫及瘀血狀態的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2016;22(23):149-54.

6王文勝,陳 偉,沈堡壘,等.上、下坡跑臺訓練膝骨關節炎模型大鼠關節軟骨及炎癥因子的變化〔J〕.中國組織工程研究,2016;20(2):197-201.

7王文勝,陳 偉,沈保磊,等.強骨寶對去勢大鼠原發性膝骨關節炎關節軟骨影響的實驗研究〔J〕.風濕病與關節炎,2016;5(4):10-3.

8姚 麗,劉樹民,于書儀,等.痛風性關節炎動物模型的改良〔J〕.中國實驗動物學報,2009,17(3):210-212,后插6.

9熊 俊，朱道成，陳日新，等.基于CONSORT和STRICTOM評價灸法治療膝骨性關節炎隨機對照試驗報告質量〔J〕.中國針灸,2015;35(8):835-9.

10Spaans AJ,van Minnen LP,Kon M,etal.Conservative treatment of thumb base osteoarthritis:a systematic review〔J〕.J Hand Surg Am,2015；40(1):16-21.

11周 炎,鄧 明,賀 斌,等.大鼠誘發性骨關節炎模型構建研究進展〔J〕.國際骨科學雜志,2016;37(5):304-10.

12張榮凱,楊祿坤,葉志強,等.以關節不穩建立的大鼠骨關節炎模型〔J〕.中國組織工程研究,2013;17(37):6628-35.

13何曉紅,周穎燕,林潔華,等.熟地寄生壯骨方對膝骨關節炎模型大鼠抗炎作用的實驗研究〔J〕.中藥新藥與臨床藥理,2015;26(3):294-8.

14杜 江,黃遠鵬,李奕修,等.龜鹿二仙膠及其拆方對去勢骨關節炎大鼠血清雌二醇濃度及膝關節軟骨細胞Ⅱ型膠原表達的影響〔J〕.中醫正骨,2013;25(3):11-20.

15Berenbaum F.Osteoarthritis as an inflammatory disease(osteoarthritis is not osteoarthritis!)〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2013;21(1):16-21.