生血寧片對腫瘤壞死因子α誘導的白細胞活化的影響及相關機制

朱 彤 饒井芬 李青山

(承德醫學院附屬醫院腫瘤科，河北 承德 067000)

炎癥反應是冠狀動脈粥樣硬化、感染性休克等多種疾病的病理基礎，白細胞與內皮細胞的黏附、跨內皮移行是炎癥反應的主要環節〔1，2〕。生血寧片的主要成分為蠶砂提取物，具有益氣補血的功效，對貧血癥狀有較好療效。最新研究發現，生血寧片可有效減輕不良炎癥反應，降低炎癥相關疾病的復發率〔3〕，但其作用機制仍未明確。為此，本次研究通過觀察生血寧片對炎性介質腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導的人外周血中性白細胞與內皮細胞黏附和游出的影響并分析其相關機制，為炎癥相關疾病治療提供新的可能。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 生血寧片(武漢聯合藥業有限公司，國藥準字Z20030088)，TNF-α、1640細胞培養液(上海元龍生物技術有限公司)，CD11b、CD18抗體(上海廣銳生物科技有限公司)，人髓過氧化物酶ELISA試劑盒(北京方程生物科技有限公司)；流式細胞儀(美國BD公司)，酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.2方法

1.2.1外周血中性白細胞分離 采集志愿者血液，抗凝處理后與等體積Hanks液混合均勻，加淋巴細胞分離液，室溫下3 000 r/min離心30min，取上層與中層分界面之間的白色窄型條帶為中性白細胞層，吸出后用3倍體積的1640細胞培養液混合均勻，3 000 r/min離心15 min，用細胞培養液沖洗細胞3次，離心后用含10%胎牛血清的1640細胞培養液重懸細胞，Trypan blue法檢測活細胞比例高于90%時進行后續實驗。

1.2.2細胞黏附實驗 將對數期白細胞以1×104/孔密度接種到96孔板中，細胞培養板中用含10 μg/ml纖維蛋白原和10%胎牛血清的內皮細胞基礎培養基平鋪，給藥組分別加入終濃度為1、10、100 μmol/L的生血寧片，37℃ CO2孵箱中培養60 min，之后滴加20 ng/ml的TNF-α，37℃靜置60 min，取上清后按ELISA試劑盒說明書依次加入反應液，讀取450 nm處的吸光度值。

1.2.3跨膜遷移實驗 采用Transwell小室法，將肺動脈內皮細胞加入3 μm孔徑的流動小室，用含10%胎牛血清的內皮細胞培養液培養48 h。按2×106/孔密度在流動小室表面平鋪中性白細胞，給藥組分別加入終濃度為1、10、100 μmol/L的生血寧片，37℃ CO2孵箱中培養60 min后再加入20 ng/ml的TNF-α，同時向流動小室底部加0.1 μmol/L的fMLP。37℃反應4 h，光學顯微鏡下行中性白細胞計數并拍照。

1.2.4表面黏附分子表達情況檢測 采用流式細胞術進行檢測，向中性白細胞懸液中滴加20 ng/ml的TNF-α，37℃反應60 min。給藥組分別加入終濃度為1、10、100 μmol/L的生血寧片，37℃ CO2孵箱中培養60 min，沉降細胞后用磷酸緩沖液沖洗，重懸細胞并滴加熒光標記的鼠抗人CD11b抗體、鼠抗人CD18抗體、陰性對照抗體，室溫下靜置30 min，上流式細胞儀檢測熒光強度。

1.3統計學分析 用SPSS21.0軟件進行F檢驗。

2 結 果

2.1生血寧片對TNF-α誘導的白細胞黏附的影響 空白對照組、TNF-α組吸光度值分別為(0.026±0.003)、(0.148±0.024)；1、10、100 μmol/L的生血寧片組的吸光度值分別為(0.129±0.034)、(0.093±0.010)、(0.062±0.017)。TNF-α組明顯提升了中性白細胞活性，黏附能力明顯強于空白對照組(P<0.01)；生血寧片對中性白細胞黏附能力的抑制呈劑量依賴性，10、100 μmol/L的生血寧片組黏附能力均明顯低于TNF-α組(P<0.05)。

2.2生血寧片對TNF-α誘導的白細胞跨膜遷移的影響 空白對照組、TNF-α組中性白細胞游出數分別為0.51、1.73×106個；1、10、100 μmol/L的生血寧片組分別為1.61、1.45、1.03×106個。TNF-α組中性白細胞跨膜遷移力明顯強于空白對照組(P<0.01)；生血寧片對中性白細胞跨膜遷移的影響也呈劑量依賴性，10、100 μmol/L組的白細胞游出數均明顯低于TNF-α組(P<0.05)。見圖1。

圖1 Transwell小室檢測結果(×400)

2.3生血寧片對TNF-α誘導的中性白細胞黏附分子表達的影響 空白對照組、TNF-α組CD11b的表達量分別為(47.25±5.91)、(187.39±12.93)；1、10、100 μmol/L的生血寧片組分別為：(206.86±16.94)、(143.31±9.67)、(91.62±18.35)。CD18的表達量分別為(97.34±4.05)、(442.91±8.04)；生血寧片組分別為：(428.42±10.30)、(360.91±8.01)、(248.39±12.36)。TNF-α組CD11b和CD18的表達量均明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；生血寧片對CD11b和CD18的表達量抑制作用呈劑量依賴性，10、100 μmol/L組的CD11b和CD18的表達量均明顯低于TNF-α組(P<0.05)。

3 討 論

炎癥反應的始發環節包括白細胞與內皮黏附、沿血管壁遷移并滲出到血管外〔4〕，其中白細胞滲出到血管外后可分泌過氧化物和炎性介質參與多種疾病發展并可引發組織損傷、多器官功能障礙。目前，臨床治療炎癥相關疾病的主要思路是對中性白細胞滲出和黏附過程進行有效的干預抑制〔5〕。本次研究顯示，生血寧片可呈劑量依賴性抑制TNF-α誘導的中性白細胞黏附能力和跨膜遷移能力。

白細胞黏附分子CD11b、CD18在介導白細胞和血管內皮黏附、游出過程中發揮重要作用〔6〕。CD11b、CD18屬于β2整合素家族，能夠與C3bi、CD54等炎癥相關配體結合，誘發白細胞及內皮的黏附，促進炎性細胞趨化性轉移、匯聚、吞噬等過程〔7〕。CD11b和CD18在正常生理狀態下也表達于白細胞表面，但受TNF-α等炎癥相關因子誘導后，中性白細胞細胞表面的CD11b和CD18的表達量明顯增加〔8〕。本次研究通過流式細胞術檢測發現，中性白細胞經TNF-α刺激誘導后炎性黏附分子CD11b和CD18的熒光表達強度明顯增加，說明生血寧片通過抑制白細胞表面黏附分子的表達，進而實現對炎性介質誘發的白細胞黏附、游出過程進行抑制，但其中生血寧片對白細胞黏附分子活化的相關機制仍需進一步研究證實。

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3李淑波，鞠文博，王春梅，等.D-半乳糖肝臟損傷動物模型的建立及其檢測〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2015;16(5)：601-4.

4Lingappa B，Sujith KV，Adhikari A,etal.One-pot synthesis of pyramid inothiazolidinones and their anti-inflammatory and antimicrobial studies〔J〕.Phosphorus Sulfur Silicon Rel Elements，2010;185(3/4)：501-8.

5張 越.乳腺浸潤性導管癌的超聲征象與血清腫瘤標志物的相關性分析〔J〕.中國衛生工程學，2016;15(3)：279-80.

6徐 婷.腎移植術受者PMNs中CD11b/CD18和MPO的表達的變化〔D〕.鄭州：鄭州大學，2011.

7江 波.重組水蛭素對大鼠皮膚撕脫傷中CD11b、CD18及ICAM-1動態表達影響的研究〔D〕.瀘州：瀘州醫學院，2012.

8Kuo PC，Li YC，Hwang TL,etal.Synthesis and structural characterization of an anti-inflammatory principle purified from Lindera aggregata〔J〕.Tetrahedron Lett，2014;55(1)：108-10.