舒肝顆粒對抑郁大鼠海馬神經元凋亡、腦組織caspase-3蛋白及外周血中細胞因子水平的影響

湯光花 陳永新 張瑞嶺

(新鄉醫學院第二附屬醫院藥學部，河南 新鄉 453002)

抑郁癥基本臨床表現為持久的心境低落、思維和行為異常的綜合征，患者易出現自卑憂郁、情緒低落、悲觀厭世，甚至自殺傾向和行為，屬于情感性精神障礙疾病。抑郁癥與失業、貧困、學習、情感、挫折等因素相關，隨著社會發展和生活節奏加快，發病率逐年上升，成為常見病和多發病〔1,2〕。抑郁癥發病復雜，可能與大腦神經遞質減少導致心理和精神活動低下有關，可能與激素異常導致炎癥細胞因子升高等有關〔3〕。抑郁癥的治療藥物有氟西汀、地昔帕明、馬普替林等，但易引起多種副作用，臨床應用受到限制〔4〕。中醫認為抑郁癥是由氣機郁滯、情志不舒導致，病因為情志內傷，病機為憂思郁怒，肝氣郁結，治宜理氣開郁，調暢氣機為主〔5〕。舒肝顆粒具有舒肝理氣，散郁調經之功，治療抑郁癥有較好的臨床療效，但其機制不清〔6〕。本文研究舒肝顆粒對抑郁大鼠海馬神經元凋亡、腦組織caspase-3蛋白及外周血中細胞因子水平的影響，探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠，雄性，體重(200±20)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。在(23±2)℃環境中采用12 h晝夜節律飼養，研究過程中自由飲水進食，白天(9：00～17：00)進行試驗研究。適應性喂養7 d后，選擇敞箱實驗評分相近的40只大鼠隨機分為對照組、模型組、舒肝組和氟西汀組各10只。

1.2藥品與試劑 舒肝顆粒，昆明中藥廠有限公司，生產批號：20151026；氟西汀，美國禮來公司，生產批號：L01984；羧甲基纖維素鈉和caspase-3試劑盒購于英國Abcam 公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-2和IL-8試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司；TUNEL 凋亡試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)和二抗購于寶生物工程有限公司；其他試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.3實驗儀器 LDZ-2 型低速離心機(北京京立離心機有限公司)；WGY-10型分分光光度計(天津光學儀器有限公司)；Mini-PROTEAN3電泳、ELx800酶標儀及Mini-PROTEAN3 電轉移系統(美國伯騰儀器有限公司)；電子天平(瑞士梅特勒公司)；超低溫冰箱(合肥美菱股份有限公司)；倒置x51顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)。

1.4模型建立 對照組正常飼養。將模型組、舒肝組和氟西汀組單籠孤養，在飼養的21 d中給予慢性輕度不可預見性應激，包括60 s高速水平震蕩和夾尾、24 h禁水、48 h禁食30 min懸吊、45℃條件下5 min熱應激、4℃條件下5 min冷刺激、 晝夜顛倒等不可預見性應激。模型組自由飲水進食，舒肝組第2天開始灌服舒肝顆粒，劑量200 mg/kg，氟西汀組第2天開始灌服氟西汀，劑量1.2 mg/kg，舒肝組和氟西汀組每天灌胃1次，連續20 d。

1.5行為學評價 21 d后采用敞箱實驗評價各組行為學。在一80 cm×80 cm×40 cm四壁涂黑的正方形紙板箱底面畫25 cm正方形，將大鼠放入箱底，安靜狀態下記錄3 min內大鼠水平、垂直運動和修飾次數。然后進行糖水消耗實驗，大鼠給予純水和1%蔗糖水，記錄24 h的消耗量。糖水偏愛度=1%蔗糖水量/總水量×100%。

1.6神經元檢測 行為學測試完畢后，眼球取血處死動物。在 4℃迅速取腦，生理鹽水清洗后，冰凍切片，選取海馬組織切片，PBS洗滌3次，貼片，晾干，二甲苯脫脂，酒精脫水，焦油紫染色，水清洗，鹽酸-酒精分色，酒精脫水后中性樹膠封片。切片脫蠟脫水，蛋白酶K 消化，PBS 清洗，滴加 TUNEL試劑盒反應液和復合液，DAB 顯色，蘇木素復染并封片。顯微鏡下隨意取 5個視野，觀察海馬神經元形態改變和海馬區棕褐色凋亡細胞數。

1.7caspase-3蛋白分析 眼球取血處死動物后取腦組織，凍存管分裝，液氮保存。解凍后研磨腦組織，加入預冷的蛋白裂解液，4℃條件下10 000 r/min 離心20 min，取上清，采用蛋白質定量試劑盒測定總蛋白。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離腦組織總蛋白，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，PBS洗10 min。蛋白封閉后，GAPDH為內參，加入caspase-3 一抗和二抗，以1∶1 000耦聯辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG孵育30 min，暗室曝光、顯影、晾干，凝膠圖像處理軟件分析光密度值。

1.8細胞因子檢測 21 d處死實驗動物，采集外周血，3 000 r/min離心15 min，分離血清后-80℃保存。采用ELISA法測定外周血TNF-α、IL-2和IL-8細胞因子水平，嚴格按照試劑說明書操作。

1.9統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行χ2、t檢驗。

2 結 果

2.1行為學評價 21 d后模型組、舒肝組和氟西汀組行為學指標明顯低于對照組，而舒肝組和氟西汀組明顯高于模型組(P<0.05)。舒肝組和氟西汀組行為學指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2海馬神經元 對照組海馬神經元細胞排列規則，細胞豐富，神經元胞膜完整，胞核形態正常；模型組海馬神經元細胞排列不規則，細胞減少，細胞紊亂變稀，神經元胞膜破裂，細胞脫落形成空泡；舒肝組和氟西汀組海馬神經元細胞排列較規則，細胞較豐富，神經元胞膜較完整，部分細胞萎縮、核變小，有部分空泡。見圖1。

表1 各組行為學評價、海馬神經元凋亡數和腦組織caspase-3蛋白表達及外周血細胞因子水平

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

模型組、舒肝組和氟西汀組海馬神經元凋亡數明顯高于對照組，而舒肝組和氟西汀組低于模型組(P<0.05)，但舒肝組和氟西汀組海馬神經元凋亡數差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 各組海馬神經元形態(×200)

2.3腦組織caspase-3蛋白表達 模型組、舒肝組和氟西汀組腦組織caspase-3蛋白表達明顯高于對照組，舒肝組和氟西汀組明顯低于模型組(P<0.05)，舒肝組和氟西汀組腦組織caspase-3蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4外周血中細胞因子 模型組、舒肝組和氟西汀組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明顯高于對照組，舒肝組和氟西汀組顯著低于模型組(P<0.05)。舒肝組和氟西汀組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

3 討 論

抑郁癥發病機制復雜，可能與單胺類神經遞質、甲腎上腺素、膽堿能-去甲腎上腺素等有關，大腦神經遞質在神經突觸間濃度減少，導致心理功能和精神活動低下，抑郁癥海馬神經細胞的凋亡相關，海馬神經元凋亡是神經退行性病變的主要病理基礎〔7〕。近年來發現抑郁癥患者免疫活化產生細胞因子，外周血TNF-α、IL-2等細胞因子與抑郁癥密切關系〔8〕。抑郁癥屬中醫郁病范疇，郁病主要由七情所傷、情志不遂或郁怒傷肝、肝郁氣滯而發病，病位在肝，因此，治郁之要，在于疏肝〔9，10〕。舒肝顆粒源于丹梔逍遙散，由當歸、白芍等10味中藥組成，具有疏肝解郁、清肝瀉火、寧心安神之功，治療郁病具有較好的臨床療效，但其作用機制尚不清楚〔11〕。本研究提示舒肝顆粒治療抑郁癥具有較好的療效。舒肝顆?？尚迯蜕窠浽毎麚p傷，降低腦組織caspase-3蛋白表達，可能是由于舒肝顆粒方中柴胡和薄荷為君藥，疏肝解郁，調達肝氣；當歸、白芍為臣藥，養血斂陰，柔肝緩急；白術、干姜、甘草為佐藥，和中補土，運化脾胃，生化營血；丹皮、桅子為使藥，清宣郁熱、解郁除煩。諸藥配伍具有疏肝解郁、清肝瀉火、寧心安神功效〔11，12〕。柴胡皂苷通過激活凋亡途徑上游蛋白caspase-9，激活下游凋亡蛋白caspase-3，產生促進細胞凋亡作用〔13，14〕。梔子恢復海馬的結構與功能，通過抗焦慮治療抑郁癥。本研究提示舒肝顆?？山档屯庵苎屑毎蜃颖磉_。這與柴胡疏肝解郁，柴胡皂苷可有效抑制海馬區細胞形態和活性，減少海馬區神經細胞凋亡，減少外周血TNF-α、IL-2和IL-8的產生有關〔15，16〕。

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