三陰乳腺癌中TIMP-1表達與臨床病理及預后的相關性

徐 凱 李宏偉 魏永鴿 付金芳

(黃河科技學院，河南 鄭州 450063)

乳腺癌根據分子表型的不同分為不同的亞型，其中三陰性乳腺癌(TNBC)是指缺乏雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體(HER)2的乳腺癌，約占總乳腺癌的15%〔1〕，其發病年齡早，易發生遠處轉移，惡性程度高，預后較差。TNBC其ER表達陰性，患者并不能受益于內分泌治療，而針對HER2的靶向治療在TNBC患者的治療中也無法發揮作用〔2〕。基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1是一種多功能蛋白，直接參與了細胞凋亡和侵襲轉移等過程〔3〕。流行病學研究表明，TIMP-1與多種腫瘤的不良預后相關〔4〕。目前關于TIMP-1在乳腺癌中的研究，多集中在化療耐藥及侵襲轉移等方面，而TIMP-1與乳腺癌患者不良預后之間的關系尚不明確。本研究主要探討TIMP-1在TNBC中的表達及與臨床病理和預后的關系。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集1998年9月至2011年9月入住黃河科技學院附屬醫院的TNBC患者的術后石蠟標本99例，均經病理學確診，患者年齡34～66歲，平均(49.3±15.9)歲，患者均有完整的病歷資料，簽署知情同意書，并經醫院倫理委員會審核同意。

1.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 胰酶消化收集細胞(本研究中所有細胞株均購自中國科學院細胞庫，細胞培養均遵循標準流程)，各細胞樣品中加入1.0 ml Trizol(美國Invitrogen公司)，抽提總RNA，按照RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)的說明書操作。紫外分光光度計(美國Thermo公司)檢測總RNA濃度及純度，逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)進行逆轉錄，cDNA產物置于-20℃保存備用。RT-PCR引物序列(上海英駿生物技術有限公司)，見表1。RT-PCR擴增儀(ABI PRISM?7300，美國ABI公司)檢測TIMP-1 mRNA表達水平。qRT-PCR擴增體系為20 μl，反應條件：50℃孵育2 min，95℃ Taq酶活化10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，進行35個循環。采用2-ΔΔCt方法表示相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3蛋白免疫印跡試驗(WB) 胰酶消化后收集各組的細胞，RIPA蛋白裂解液抽提全蛋白樣品，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)檢測蛋白濃度。12%十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠(SDS-PAGE)膠電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h，TBS-T洗膜，然后分別用兔抗人單克隆TIMP-1抗體(ab109125，美國Abcam公司，稀釋比例1∶1 000)、兔抗人β-actin抗體(武漢博士德生物技術公司，稀釋比例1∶300)，4℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物技術公司，稀釋比例1∶5 000)，室溫孵育1 h，加電化學發光(ECL)發光液(美國Millipore公司)進行化學發光顯影，凝膠成像儀(美國UVP公司)觀察蛋白條帶。實驗重復3次。

1.4免疫組織化學(IHC) 石蠟切片，常規脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，微波修復抗原，滴加正常山羊血清室溫封閉20 min，棄去血清，分別滴加TIMP-1一抗工作液(1∶150)，4℃孵育過夜，PBS洗滌后，滴加生物素二抗(上海信則生物科技有限公司)，室溫孵育40 min，PBS洗滌后，二氨基聯苯胺(DAB)顯色30 s，沖洗，蘇木素復染2 min，封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判斷：采用Mathew積分法〔5〕進行結果判斷。每例標本均選擇10個含有陽性細胞的高倍視野(×400)分別計數100個腫瘤細胞，取其平均值計算陽性細胞百分率。在統計分析中，將>3分判定為高表達；≤3分定為低表達或者陰性。

1.5統計學方法 應用SPSS19.0軟件行t檢驗，χ2檢驗比較各組間陽性率，患者5年總生存率采用Kaplan-Meier生存曲線法，組間比較為Logrank檢驗。

2 結 果

2.1TIMP-1在非TNBC細胞與TNBC細胞中的表達情況 qRT-PCR結果顯示，TIMP-1 mRNA表達量在TNBC細胞(MDA-MB-231，MDA-MB-468，MDA-MB-435)中顯著高于非TNBC細胞(MCF-7，BT474，SK-BR-3)(P<0.05)。見表2。WB結果表明，TIMP-1在TNBC細胞(MDA-MB-231，MDA-MB-468，MDA-MB-435)中的蛋白表達高于非TNBC細胞(MCF-7，BT474，SK-BR-3)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表3。

表2 TIMP-1在不同乳腺癌細胞株中的mRNA表達

圖1 TIMP-1在不同乳腺癌細胞株中的表達水平

組別細胞株蛋白表達非TNBCMCF-70.35±0.030.16±0.15BT4740.02±0.00SK-BR-30.12±0.01TNBCMDA-MB-2310.56±0.054.85±0.97MDA-MB-4680.77±0.02MDA-MB-4350.83±0.04t/P值8.390/0.000

2.2TIMP-1在TNBC組織中的表達 免疫組織化學染色結果顯示，TIMP-1主要分布于細胞質和細胞間隙，強陽性染色。見圖2。

2.3TIMP-1表達水平與TNBC臨床病理參數之間的關系 TIMP-1表達水平的高低與TNBC患者的腫瘤復發及是否存活有關(P<0.05)，而與患者的年齡，絕經狀態，腫瘤大小，淋巴結轉移及TNM分期無關(P>0.05)。見表4。

臨床參數nTIMP-1表達高水平(>3分)低水平(≤3分)χ2值P值年齡(歲)<457344(60.3)29(39.7)0.2120.645≥452617(65.4)9(34.6)絕經狀態絕經前4726(55.3)21(44.7)1.5000.221絕經后5235(67.3)17(32.7)腫瘤大小(cm)≤34932(65.3)17(34.7)0.5580.455>35029(58.0)21(42.0)淋巴結轉移無2517(68.0)8(32.0)0.5760.448有7444(59.5)30(40.5)TNM分期Ⅰ+Ⅱ148(57.1)6(42.9)0.1380.710Ⅲ+Ⅳ8553(62.4)32(37.6)復發是8154(66.7)27(33.33)4.8050.028否187(38.9)11(61.1)存活是216(28.6)15(71.4)12.3060.000否7855(70.5)23(29.5)

2.4TNBC組織中TIMP-1表達水平與患者生存率之間的關系 本研究中99例TNBC患者的病理資料均完整，隨訪3～60個月，其中死亡病例78例。單因素分析TIMP-1對預后的影響，將TIMP-1表達水平分為低表達組(38例)與高表達組(61例)，繪制Kaplan-Meier生存曲線，結果顯示TIMP-1高表達的TNBC患者的術后5年總生存率為9.8%(6/61)，顯著低于TIMP-1低表達的39.5%(15/38)(χ2=6.324，P=0.000)，且TIMP-1低表達組的生存時間為3～60個月，平均(46.7±3.2)個月，而TIMP-1高表達組的生存時間為3～60個月，平均為(31.5±2.4)個月，TIMP-1高表達患者的生存時間較低表達患者顯著減少(χ2=11.014，P=0.010)。見圖3。

圖3 TNBC患者組織中TIMP-1表達水平與患者生存率之間的關系

3 討 論

惡性腫瘤侵襲轉移過程中，細胞外基質(ECM)的降解是關鍵環節，在生理狀態下，ECM處于動態平衡。基質金屬蛋白酶(MMPs)是鈣離子和鋅離子依賴的蛋白水解酶，是降解ECM的主要介質。TIMP-1是一種小分子分泌糖蛋白，具有多種生物學功能，包括抗凋亡和抑制MMPs活性等〔6〕。TIMP-1通過調節MMPs的活性而調控ECM的合成與降解。有研究發現，TIMP-1以可逆的非共價鍵形式與MMPs形成復合物，TIMP-1能夠抑制幾乎所有的MMPs，尤其是MMP-9〔7〕。

作為TIMP蛋白家族成員之一，TIMP-1最初被定義為MMPs抑制劑和去整合素樣金屬蛋白酶10(ADAM10)〔8〕；但是近年來，越來越多的研究在關注TIMP-1作為細胞因子樣的功能〔9〕。實驗研究已經證實，在多種腫瘤組織中，TIMP-1的表達水平是升高的，這其中包括乳腺癌〔10〕。乳腺癌是一種高度異質性的疾病，可根據分子表型的不同分為不同的亞型，如Luminal A型，Luminal B型等。TNBC具有發病年齡早，惡性程度高，預后極差等特點，由于缺乏ER以及HER2，TNBC患者并不能受益于內分泌治療以及HER2靶向治療，在臨床上尚無有效的治療靶標。目前對于TIMP-1在TNBC中所發揮的功能及分子機制尚不明確〔11〕。

本研究中，在TNBC細胞株中(MDA-MB-231，MDA-MB-468，MDA-MB-435)，TIMP-1 mRNA和蛋白表達水平顯著高于非TNBC細胞(MCF-7，BT474，SK-BR-3)。與Chang等〔12〕的研究結果一致，TIMP-1的高表達可能促進了乳腺癌的惡性轉化。表觀遺傳學研究證實，與非TNBC患者相比，TNBC患者中，TIMP-1的啟動子低甲基化，啟動子活性增強，TIMP-1的轉錄翻譯增加，使得TIMP-1 mRNA和蛋白表達水平均升高〔13〕。此外，本研究還發現，TIMP-1可能成為一個獨立的評估TNBC的指標。說明在TNBC患者中，TIMP-1的高表達有可能作為預測患者不良預后的靶標。大量研究結果已經證實，TIMP-1的表達水平與癌癥患者的不良預后密切相關，如結腸癌〔14〕，肝細胞癌〔15〕，黑色素瘤〔16〕等。 TIMP-1作為一種分泌蛋白，能夠分泌到腫瘤的微環境中，可以通過免疫靶向抑制TIMP-1或者TIMP-1受體，阻斷TIMP-1的活性，從而達到靶向治療的目的〔17〕，提高TNBC患者的預后。

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6Nalluri S，Ghoshal-Gupta S，Kutiyanawalla A，etal.TIMP-1 inhibits apoptosis in lung adenocarcinoma cells via interaction with Bcl-2〔J〕.PLoS One，2015；10(9)：e0137673.

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