肝癌患者外周血淋巴細胞轉錄因子的表達及意義

戴 丹 胡東輝 張建軍

(湖北省中山醫院肝病科，湖北 武漢 430033)

在我國，由于乙型肝炎病毒(HBV)高發病率，肝癌是第二大最常見的惡性腫瘤〔1，2〕。目前對晚期肝癌的治療選擇有限，研發有效的肝癌治療方法是非常有必要的。以樹突細胞(DC)為基礎免疫治療肝癌患者的研究表明DC接種和免疫治療可能是一個安全有效的肝癌治療方案〔3〕。已知每個T細胞亞群的分化和功能由特定的轉錄因子(TF)調控，如Runx1和Runx3，這些TF在Th1與Th2激活或沉默細胞因子轉錄基因、γ干擾素(IFN-γ)和白細胞介素(IL)-4的過程中，Th直接與表達于T細胞的T-box(T-bet 和GATA3)相互作用〔4〕。與之相應的特異性TF分別為T-bet和GATA-3。研究表明Th1/Th2細胞平衡或失衡在一些生理病理過程中起重要作用〔1，2，5〕，檢測這些細胞相對應的TF比值，即T-bet/GATA-3，會更客觀反映Th1/Th2細胞分化〔3,6〕。因此，研究Th1/Th2細胞在其TF水平的平衡結果將更為顯著。本研究中，我們采用熒光實時定量PCR(RT-qPCR)法檢測肝癌患者和健康對照者外周血單個核細胞(PBMC)的Th1-、Th2-特異性TF(分別為T-bet，GATA-3)mRNA表達水平，以闡明Th1/Th2細胞失衡與肝癌間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 湖北省中山醫院2014年1月至2015年1月初次診斷為肝癌并需外科手術治療的患者23例為肝癌組，體檢中心健康者21例為對照組，均無自身免疫性疾病(如糖尿病，甲狀腺功能亢進等)和免疫治療等病史。肝癌組中有乙型肝炎病史者19例。與對照組相比，肝癌組谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、總膽固醇(TC)均顯著升高(P<0.05)。兩組年齡、性別、漢族比例、體重指數(BMI)、堿性磷酸酶(ALP)等無差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般臨床特點

1.2方法 采集所有受試者的空腹外周靜脈血標本，收集于真空血液收集管中，以乙二胺四乙酸(EDTA)為抗凝血劑，并于采樣后4 h內完成樣本處理。

1.3主要儀器和試劑 ABI 7500自動熒光定量PCR儀，ABI 9700 PCR儀和ABI 3900高通量DNA合成儀均購自Applied Biosystems Inc.(美國)。ELITE 200電泳設備和Dolphin-DO凝膠成像系統購自WEALTEC(美國)。RCO3000T-5-VBC CO2細胞培養孵化器購自KENDRO(美國)。CK40-32PH倒置顯微鏡購自奧林巴斯(東京，日本)。Trizol法RNA提取試劑盒購自TaKaRa(日本)。反轉錄緩沖液(5×)，PCR緩沖液，Taq酶購自達納基因(中國廣州)。人體淋巴細胞分離管購自達科為生物技術公司(中國深圳)。 RPMI1640細胞培養基購自Gibco(美國)。

1.4PCR引物的設計和合成 在GenBank搜索靶基因(T-bet，GATA-3)的mRNA序列，采用Primer Express2.0軟件進行基因引物設計。引物序列：T-bet上游引物：5'-CGGCTGCATATCGTTGAGGT-3'，下游引物：5'-GTCCCCATTGGCATTCCTC-3'，擴增片段：107 bp；GATA-3上游引物：5'-TCATTA AGCCCAAGCGAAGG-3'，下游引物：5'-GTCCCCATTGGCATTCCTC-3'，擴增片段：107 bp；β-actin上游引物：5'-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3'，下游引物：5'-TCGTCCCAGTTGGTGACG AT-3'，擴增片段：106 bp。

1.5細胞總RNA提取和實時PCR(RT-PCR) 用含有淋巴細胞分離液的淋巴細胞分離管分離外周靜脈血淋巴細胞。調節淋巴細胞至(1～5)×106/ml，并在37℃、5%CO2培養箱中溫育培養4～8 h，使細胞附著管壁。分離淋巴細胞，于離心機在12 000 r/min離心15 min，收集懸浮淋巴細胞。用Trizol試劑溶解沉淀細胞。根據試劑盒說明書從淋巴細胞中分離總RNA。4 μl模板RNA用于逆轉錄反應，在ABI 9700進行，條件：37℃保溫1 h，95℃ 3 min。5 μl反轉錄cDNA模板用于PCR反應，采用ABI 7500自動熒光定量PCR儀。用無菌雙蒸水用作陰性對照。PCR條件：93℃變性3 min，然后93℃ 30 s、55℃ 45 s和72℃ 45 s反應40個循環。PCR完成后，由計算機軟件進行自動分析數據，計算靶基因和內參基因拷貝數。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

肝癌組PBMC T-bet mRNA水平顯著低于對照組(P<0.01)，GATA-3 mRNA水平顯著高于對照組(P=0.024)，T-bet mRNA/GATA-3 mRNA明顯低于對照組(P=0.031)，見表1。

表1 兩組T-bet、GATA-3 mRNA表達水平比較

3 討 論

目前對晚期肝癌的治療選擇有限，研發有效的肝癌治療方法是非常有必要的。既往研究表明，Th1/Th2比例失衡可能導致一些疾病的發生，如癌癥、自身免疫性疾病、過敏性疾病、內分泌疾病、感染性疾病和器官移植排斥反應〔7,8〕。正常情況下，Th1細胞，Th2細胞與Th17細胞結合，最終形成CD4+T效應細胞調節網〔9〕。當幼稚CD4+T細胞受外部抗原的刺激，其根據不同細胞因子的作用而增殖和分化成多種CD4+T效應細胞。IL-12和IFN-γ誘導幼稚CD4+T細胞向Th1細胞分化。IL-12是決定CD4+T分化成Th1細胞的一個關鍵細胞因子，與其受體IL-12R的結合可誘導和激活信號轉導因子和轉錄蛋白(STAT)4的活化，這可上調IFN-γ，并可激活STAT1和Th1細胞分化的特異TF-T-bet〔10〕。Th1細胞產生的IFN-γ可調節細胞免疫和抗移植物反應，并起到抗感染和抗腫瘤的重要作用。而IL-4可誘導活化的CD4+T細胞分化成Th2細胞。IL-4與其受體IL-4R結合，激活STAT6，也激活Th2細胞特異性的TF GATA-3〔11,12〕。Th2細胞分泌IL-4，IL-5和IL-13，這可調節體液免疫和過敏反應，并參與系統性自身免疫性疾病的發生。

Th2型細胞因子在惡性皮膚癌患者表達顯著，而Th1型細胞因子則主要表達于良性皮膚癌患者〔13〕。此后，在許多惡性腫瘤中觀察到Th2型細胞因子，包括非小細胞肺癌、絨毛膜癌和神經膠質瘤〔14，15〕。研究發現在肝癌外周血Th1/Th2細胞比例失衡，顯示Th2型細胞因子優勢表達，并有隨臨床分期及疾病惡化程度增加而增加的趨勢，表明Th2型細胞因子的表達與原發性肝癌的進展有關〔16〕。 TF GATA-3的優勢表達也發生于乳腺癌和胰腺癌〔17，18〕。本研究表明，肝癌患者PMBC T-bet的表達降低而GATA-3的表達增加，T-bet/GATA-3比值顯著降低，且GATA-3表達顯著，顯示在轉錄水平存在Th2細胞漂移。Th2細胞漂移是癌細胞免疫逃逸的常見機制之一，且與癌癥發生、發展、轉移和再發生有關。因此，糾正Th1/Th2細胞失衡可能是癌癥免疫療法的一個重要途徑。

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