深圳地區250例地中海貧血基因檢測結果研究

李智文

資料顯示［1］, 地貧廣泛分布于世界各地區, 東南亞為地貧高發地區。地貧尚無較理想的治療方案, 通過預防監控并及時采取干預措施是目前的一種重要手段, 關鍵環節在于篩查婚前育齡男女, 降低地貧患兒的出生率。本研究通過常規篩查試驗、RDP、Gap-PCR、巢式PCR及PCR-SBT技術對250例地貧患兒的基因檢測結果進行分析, 現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2016年6月～12月來本院進行篩查的疑似地貧兒童3065例為研究對象。納入標準：家族中有地貧患兒、地貧基因攜帶者；每分鐘最大通氣量(MVV)＜80 fl。排除有其他血液系統疾病者。本研究符合本院倫理學標準,經倫理委員會批準, 納入研究對象及家屬均知情且同意參與研究。3065例受檢者中有女1368例, 男1697例；年齡1個月～15歲, 平均年齡(2.5±4.2)歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 抽取研究對象2 ml的肘靜脈血, 試管中有抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)二鉀, 血液標本于常溫條件下保存以備檢驗。

1.2.2 血常規檢查 借助XE-2100型分析儀檢測研究對象的血樣, 操作流程嚴格遵照儀器說明書, 對血紅蛋白(Hb)、紅細胞比容(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞(RBC)等指標進行測定。參照文獻［2］中相關內容對檢查結果進行分析。不管受使對象MCV正常與否, 均照常行Hb電泳與RBC脆性檢測。

1.2.3 Hb電泳、RBC脆性檢測 參照葉應嫵等［3］編制“臨床檢驗操作流程”中的相關操作標準, 借助毛細管電泳儀對血液標本行Hb電泳分析；在一定電壓、緩沖液的條件下,8條石英毛細管并聯行Hb電泳, 在波長415 nm處測定血紅蛋白A2(HbA2)水平；注意在電泳分析時, 對廠家配套質控品先進行測定, 在室內質控合格的前提下才能測定待檢標本；依據張之南等［4］編著的“血液病診斷、療效標準”中有關地貧的診斷標準對測定結果進行分析判定。RBC脆性檢測使用一管定量篩查法, 操作步驟嚴格遵照試劑盒說明書進行；如RBC脆性＜70%, 則行地貧基因檢測。

1.2.4 HKαα 型基因檢測 如果受檢者的 MCV＜80 fl、HbA2≤3.5%、RBC脆性＜70%, 且Gap-PCR檢測無法確診則應對其血液標本行進一步的檢測；采用巢式PCR對地貧HKαα基因型檢測分析。

1.2.5 基因測序 如果受檢者的MCV＜80 fl、血紅蛋白A2(HbA2)＞3.5%、RBC 脆性 ＜70%, 且 RDB 檢測無法確診則進一步檢測其血液標本；利用PCR-SBT技術進行地貧基因測序。

2 結果

2.1 常見基因型結果 在本院篩查的3065例受檢者中,519例的篩查試驗結果呈陽性, 經常見基因型分析后250例確診為地貧, 檢出率為48.17%(250/519)。確診患者中α地貧131例(52.40%, 131/250), 其中α地貧2基因型30例(22.90%)、α地貧1基因型89例(67.94%)、HbH病基因型12例(9.16%)。131例α地貧患兒中東南亞缺失型(--SEA/αα)、α地貧2(-α3.7/αα)占 比 高 , 分 別 為 59.54%(78/131)、15.27%(20/131)；αCSα/αCSα、αWSα/αWSα、αQSα/αQSα 基因型及 --SEA/αCSαCS、--SEA/αWSαWS、--SEA/αQSαQS、-α3.7/αQSαQS等HbH病基因型均少見；確診為αWSα/αCSα罕見突變基因型的1例。確診為β地貧112例(44.80%, 112/250), 其中β雜合子基因型、β純合子基因型、β雙重雜合子基因型各102例(91.07%)、4例(3.57%)、6 例 (5.36%)；β41-42(-TCTT)/βA、β654(C＞T)/βA檢出率較高 , 分別達 33.93%(38/112)、30.36%(34/112)；確診為β復合α地貧者有7例, 3例(42.86%)為β復合--SEA/αα。

2.2 HKαα基因型結果 檢出α地貧罕見基因型2例(0.39%, 2/519), HKαα/--SEA、HKαα/αα 各有 1 例。

2.3 β地貧罕見基因型PCR-SBT測序結果 在檢出的3例 β 罕見基因型病例中 , β37(G＞C)、β88-93(-AGTC)、β-88(C＞T)各 有 1例 , 前 者 的 突 變 點 為 405G＞A 或 是413G＞A；后兩者的突變點分別于557處有雜合峰、-88處有雜志峰 (C＞T)。

3 討論

地貧是一種血紅蛋白病, 人體在血紅蛋白基因缺失或突變的情況下使得α和β珠蛋白肽鏈合成速率失調, 從而出現溶血性貧血。世界衛生組織(WHO)的數據顯示, 全球攜帶致血紅蛋白病基因者達到4.5%, 每年平均有20萬以上患有各類地貧的新生兒出生, 地貧對我國的廣東、廣西等南方地區影響大, 這些省份中有1.2%～8.1%的人群患有重型α地貧［5］。本研究3065例受檢者中, 519例的篩查試驗結果呈陽性, 經常見基因型分析后250例確診為地貧, 檢出率為48.17%(250/519)。確診患者中α地貧131例(52.40%, 131/250), 其 中 α 地 貧 2 基 因 型 30 例 (22.90%)、α地貧1基因型89例(67.94%)、HbH病基因型12例(9.16%)。131例α地貧患兒中東南亞缺失型(--SEA/αα)、α 地 貧 2(-α3.7/αα)占 比 高 , 分 別 為 59.54%(78/131)、15.27%(20/131)；αCSα/αCSα、αWSα/αWSα、αQSα/αQSα 基因型及 --SEA/αCSαCS、--SEA/αWSαWS、--SEA/αQSαQS、-α3.7/αQSαQS等HbH病基因型均少見；確診為αWSα/αCSα罕見突變基因型的1例。確診為β地貧112例(44.80%, 112/250), 其中β雜合子基因型、β純合子基因型、β雙重雜合子基因型各102例(91.07%)、4例(3.57%)、6 例 (5.36%)；β41-42(-TCTT)/βA、β654(C＞T)/βA檢出率較高, 分別達33.93%(38/112)、30.36%(34/112)；確診為β復合α地貧者有7例, 3例(42.86%)為β復合--SEA/αα。這一結果與貴州、重慶地區有差異, 兩地主要類型為β17(A＞T)。表明深圳作為外來人口較多的城市, 其地貧基因型的分布特點獨特。利用巢式PCR技術檢出HKαα的確診率為0.39%(2/519), 比廣西地區的0.07%高, 這可能與深圳特有的分布構成有關, 這提示在臨床工作中應綜合分析可疑病例的檢測結果, 減少誤診、漏診的發生。本研究應用RDB技術對已知位點突變的基因型進行檢測, 如果突變點未知則應運用PCR-SBT法, 此法能夠對堿基突變點進行直接檢測。本研究通過PCR-SBT法檢出新的堿基突變點, 發現β37(G＞C)、β88-93(-AGTC)、β-88(C＞T)3 個罕見基因型 ,地貧確診率為0.58%(3/519)。但是總結臨床實踐經驗與理論知識發現, 在基因序列分析中應對堿基突變點給予更多關注,以免因堿基插入形成連續套峰而誤認為其為PCR-SBT擴增不成功所致, 加大誤診、漏診率。

綜上所述, 臨床應充分利用常規篩查試驗、借助RDB、Gap-PCR、SBT、巢式PCR技術對地中海貧血患兒進行基因檢測, 并對結果進行綜合分析, 旨在為婚前、孕前、孕期地貧的篩查與基因診斷提供參考。