超聲微泡攜基因治療肝臟疾病應用進展

席佳達，夏國園*，程祖勝

(1.紹興文理學院醫學院，浙江 紹興 312000；2.紹興市第七人民醫院放射科，浙江 紹興 312000)

隨著超聲微泡造影劑(ultrasound contrast agent, UCA)、超聲靶向微泡破壞(ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)技術與超聲微泡攜基因(ultrasound microbubble carrying gene, UMCG)技術的發展與成熟，超聲微泡的治療作用日漸突顯, 通過靶向微泡造影劑(targeted microbubbles contrast agent, TMCA)靶向傳輸基因、UTMD的空化效應增強基因的轉染率，可靶向治療疾病。UMCG已用于治療多種疾病。本文主要圍繞UMCG治療肝臟疾病的應用進展進行綜述。

1 概述

1.1UCA的發展 UCA的發展歷經3個階段：第1代造影劑內含自由氣體，無外膜包被，顆粒較大，穩定性差；第2代造影劑外包白蛋白、脂質、表面活性劑或聚合物等殼膜，穩定性增加，直徑也縮小至8 μm以下，可通過靜脈注射；第3代造影劑內含氟碳或氟硫類氣體，外有殼膜包被，可在血液中持續15 min以上，穩定性大大提高。

1.2TMCA 與普通UCA相比，TMCA表面連接特異性的配體或抗原，經靜脈注射后可到達感興趣區。各類藥物或基因通過共價鍵或靜電連接在靶向微泡表面或直接包裹入微泡內，既能有效防止藥物或基因被血液中的物質分解，又能將藥物或基因運送至目標區域。與傳統的病毒、非病毒載體相比，微泡作為基因載體具有安全、定向及有效等特點。

1.3UTMD 通過對目標區域施加一定頻率的超聲使微泡破裂，定位釋放出微泡內的藥物或基因，產生空化效應，使血管內皮細胞及靶細胞的細胞膜通透性暫時增加、細胞間隙增寬，在細胞膜及核膜上產生聲孔，促進細胞的內吞作用，增加其對大分子物質的吸收，使外源基因更易進入目標組織，具有安全性高及靶向性強的特點。

2 UMCG在肝臟疾病治療中的應用

2.1肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 我國HCC發病率僅次于肺癌和胃癌，每年死亡人數達32.1萬[1]。研究[2]發現UMCG可抑制肝癌細胞轉移、生長，或誘導HCC凋亡。1986年Moolten等首次報道通過將單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)轉移到腫瘤細胞，可提高核苷類似物(nucleoside analoges, NSA)殺傷腫瘤細胞的敏感度。HSV-TK自殺基因是一種前藥酶基因，可通過磷酸化作用使前藥丙氧鳥苷(ganciclovir, GCV)轉變為細胞毒性藥物，達到抗腫瘤作用。Zhou等[3]利用超聲靶向破壞包裹HIV-TK基因的質粒，經過48 h轉染后，HSV-TK+超聲+微泡+GCV組胸腺激酶(thymidine kinase, TK)蛋白表達明顯增強，而TK蛋白在目標區域的有效表達是HSV-TK/GCV治療腫瘤的基礎。HIFU可將超聲聚焦，瞬間產生高溫，使腫瘤細胞發生不可逆的壞死，療效確切，但存在腫瘤消滅不完全、術后易復發等缺點。謝輝等[4]采用HIFU治療裸鼠肝移植瘤，消融80%的皮下移植瘤后，再將連接磷脂酰肌醇蛋白多糖3(glypican-3, GPC3)抗體、并攜HSV-TK基因的納米級超分子探針的微泡靶向釋放于殘瘤中，記錄移植瘤中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)及微血管密度(microvessel density, MVD)的變化，發現微泡+HSV-TK+GPC3組的VEGR、HIF-1α mRNA的轉錄水平明顯降低；且腫瘤組織中毛細血管生成受到抑制、MVD水平明顯降低，使腫瘤血供受限，從而導致腫瘤缺血壞死。李炯等[5]分析超聲微泡聯合GPC3抗體及HSV-TK在體外對人肝癌細胞株增殖及侵襲能力的影響，發現超聲輻照孵育48 h后載基因靶向微泡組轉染率明顯增高，而肝癌細胞中增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表達及侵襲細胞數明顯降低，載基因靶向微泡組的細胞凋亡率達49%。

體外合成或基因表達產生的凋亡素可引導多種惡性腫瘤細胞凋亡，但對人體正常二倍體細胞無作用。張園等[6]通過UTMD聯合半乳糖聚乙烯亞胺(galactosylated-polyethylenimine, PEL-Gal)介導凋亡素基因，探討其對小鼠肝癌移植瘤的影響，發現腫瘤組織凋亡率顯著增高，Caspase-3蛋白表達顯著增加，抑制腫瘤細胞凋亡的Bal-2蛋白表達明顯下降。

實驗研究[7-8]發現癌胚蛋白GPC3及Hippo信號通路核心效應因子Yes相關蛋白(Yes-associated protein, YAP)的表達與HCC的產生、發展、凋亡和轉移密切相關。潘青云等[9]觀察超聲輻照攜帶miR-520c-3p和miR-132微泡轉染體外培養的人肝癌細胞，發現miR-520c-3p僅能抑制GPC3mRNA蛋白的翻譯過程，引起YAP蛋白及其mRNA表達減少；而miR-132僅能抑制YAP蛋白及其mRNA表達，但對GPC3無影響；以超聲輻照攜miR-520c-3p及miR-132微泡組，48 h后其細胞增殖率及凋亡率明顯低于其余各組，提示其能顯著抑制人肝癌細胞株增殖，并促進其凋亡，其機制可能與GPC3與YAP表達的調節有關。

轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)與HCC患者預后不良有關，而被TGF-β活化的長鏈非編碼RNA(lncRNA activated by TGF-β, lncRNA-ATB)是TGF-β信號通路的關鍵調節物。同時，lncRNA-ATB還能競爭性地與miR-200結合，增加E盒結合鋅指蛋白(E-box binding zinc finger protein, ZBE)1和2的表達，從而引起上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和遷移，導致癌癥進展和轉移。Chen等[10]通過UTMD使lncRNA-ATB沉默RNA(siATB)轉染人肝癌細胞株48 h，與對照組相比，siATB+UTMD組ZEB1及ZEB2的RNA及蛋白質均明顯受到抑制，同時肝癌細胞的遷移與擴散也明顯減少。而與siRNA相比，短發夾RNA(shRNA)更加穩定。JKN信號途徑也參與某些疾病和腫瘤的發生發展過程，同時與肝癌淋巴道轉移密切相關。張宇虹等[11]通過脂質體轉染法與UTMD技術結合，分析JKN1 shRNA對小鼠肝癌細胞株的影響，發現脂質體+超聲微泡+超聲輻照組的轉染率均大于其余各組，提示肝癌細胞株JKN1表達明顯受到抑制。CD133是肝癌干細胞(Liver cancer stem cells, LCSCs)的表面標記物，能在EMT過程中發揮作用，同時也是決定HCC發生和總生存期的重要因素。Liu等[12]通過UTMD介導shCD133來分析CD133和EMT在LCSCs中的調節機制，發現通過核轉錄因子κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)途徑抑制LSCSs中的CD133可以逆轉EMT，起到抑制腫瘤增殖轉移的作用；UTMD體外轉染CD133陽性亞群肝癌細胞組內球狀細胞明顯減少，提示shCD133可抑制肝癌細胞自我更新。

Xue等[13]使用effectene轉染劑結合UTMD介導shRNA-Sox9轉染人肝癌細胞株，發現effectene+shRNA-SOX9+UTMD組轉染率明顯高于其余組，Sox9的表達明顯減少，提示其能顯著抑制肝癌細胞增殖并誘導其凋亡。

2.2肝纖維化(hepatic fibrosis, HF) 肝細胞受到慢性損傷時，肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是激活HF的中心環節。HF長期持續可轉變為肝硬化(liver cirrhosis, LC)，其發病率和死亡率均較高[14]。微泡介導的基因轉移可為治療HF提供新的可能[15]。

2.2.1基質蛋白金屬酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) MMPs可降解細胞外多數基質成分，有效緩解HF。田力等[16]通過RNAi技術構建定點干擾基質蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)表達的病毒表達載體，并用超聲微泡攜TIMP-1 siRNA，以UTMD技術轉染后，實驗組肝組織內TIMP-1、TIMP mRNA含量明顯低于模型對照組，MMP含量顯著上升，大鼠HF得到一定緩解。

2.2.2肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF) HGF能調節膠原纖維合成與炎性反應，抑制HSC活性，從而阻止HF發展[17]。Jiang等[18]通過超聲微泡介導HGF基因轉染肝臟，發現超聲-微泡-HGF組丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)含量明顯降低，而總蛋白(total protein, TP)含量明顯升高，提示大鼠HF受到抑制，肝臟功能得到改善，蛋白質合成增加。夏國園等[19]研究報道，在一定范圍內，HGF對肝纖維化的抑制作用隨治療劑量加大而增加。李文艷等[20]制備出質微泡-陽離子脂質體復合物(LMB-CNLP)，使其攜HGF基因，并給予超聲輻照，探討其對處于對數生長期的HSC株的影響，結果發現轉染24 h后熒光顯微鏡下可觀察到LMB-CNLP組熒光較多，轉染144 h后LMB-CNLP組轉染率為41.29%，HSC-T6凋亡率達32.81%，可為治療HF提供基礎實驗依據。

2.2.3結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF) CTGF被認為是基因干擾HF的潛在靶點[21-22]。楊丹等[23]采用搭載CTGF-miRNA的陽離子脂質體微泡，轉染24 h后熒光顯微鏡下已可見較多綠色熒光；載基因陽離子脂質體-微泡聯合超聲組的細胞活性與其他組差異無統計學意義，而轉染效率明顯高于其他組，表明該基因轉染方法具有安全性，也為基因干擾治療HF提供了新思路。

2.3乙型肝炎 我國每年約有100萬人死于由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)所致肝衰竭、LC和肝癌[24]?？桂げ《镜鞍譇(myxovirus resistant A, MxA)對HBV等的抗病毒活性較敏感[25]。劉愛平等[26]以超聲輻照在小白鼠肝臟處靶向表達MxA基因，與其余組相比，超聲+微泡+質粒轉染組肝組織內可見大量MxA表達陽性細胞。Ndc80是細胞分裂的相關基因，Ndc80高表達可促進細胞增殖。Liu等[27]發現Ndc80在HCC組織中的表達增加，而在由HBV引起的HCC中增加更為顯著；進一步研究顯示，與對照組相比，敲除Ndc80基因的細胞可有效抑制HBV復制，同時也能抑制與HBV相關HCC。

3 小結與展望

UMCG安全性高，靶向性好，轉染率高，應用前景十分廣闊，可為診療許多疾病提供新的思路和方法。但目前多數研究仍處于實驗階段，且許多基因治療疾病的機制尚不明確，有待進一步觀察。