膿毒癥模型的研究進(jìn)展

侯文肖，段 軍

（中日友好醫(yī)院 外科重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100029）

膿毒癥 （sepsis）是指由感染引起的機(jī)體器官功能障礙，同時(shí)伴隨著多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)、合成與釋放的綜合征[1]。由于其病理生理機(jī)制較復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制未能明確，使得臨床治療相對棘手，致使膿毒癥在臨床上擁有較高的病死率 （25%～30%），且其所致休克病死率高達(dá)50%[2，3]。研究分析表明，每年全球約有3150萬人罹患膿毒癥，死亡人數(shù)高達(dá)500多萬[4]。同時(shí)，這也是導(dǎo)致ICU患者病死率較高的重要原因[5]。為了能夠進(jìn)一步地研究膿毒癥的病理生理機(jī)制和指導(dǎo)臨床治療，就需要借助動物模型來模擬人類膿毒癥。因此，本文就近五年常見的膿毒癥動物模型的研究進(jìn)展做一綜述。

1 膿毒癥的病理生理機(jī)制

膿毒癥的致病機(jī)制尚未完全闡明，目前被研究者公認(rèn)的是當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷、感染甚至休克時(shí)，體內(nèi)各種體液系統(tǒng)和細(xì)胞系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的合成、表達(dá)和釋放。通過炎癥介質(zhì)一系列的連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生生物學(xué)放大效應(yīng)，使炎癥反應(yīng)不斷加重，引起局部和全身炎癥反應(yīng)的失控，使血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛損傷，進(jìn)一步促進(jìn)白細(xì)胞黏附并啟動凝血系統(tǒng)，引起全身器官組織損害，最終導(dǎo)致多器官功能障礙。由于對其機(jī)制認(rèn)識的有限性，因此在膿毒癥的治療上，應(yīng)用抗炎介質(zhì)和抗細(xì)胞因子臨床實(shí)驗(yàn)大都不能取得滿意的臨床效果[6]。如果能夠通過建立理想的膿毒癥動物模型真實(shí)再現(xiàn)人類膿毒癥的免疫系統(tǒng)改變，必然會對膿毒癥病理生理機(jī)制的研究和臨床治療等工作產(chǎn)生十分重要的影響。

2 膿毒癥動物模型的基本要素及理想模型

研究認(rèn)為，良好膿毒癥動物模型的制作需要具有以下必備要素：高排低阻血流動力學(xué)表現(xiàn)和高代謝狀態(tài)；伴多個(gè)器官功能障礙；有較高的自然死亡率，依據(jù)膿毒癥的病理轉(zhuǎn)歸，動物模型的自然死亡率要求達(dá)到50%～70%；膿毒癥是嚴(yán)重感染等因素引起的機(jī)體炎癥反應(yīng)過度激活造成的自身損傷，不是因?yàn)榧?xì)菌和內(nèi)毒素對機(jī)體的直接作用，故出現(xiàn)器官功能障礙及動物死亡距膿毒癥模型制備應(yīng)具有相對的時(shí)間間距[7]。在臨床上，膿毒癥發(fā)生進(jìn)展性器官功能障礙或衰竭一般需要幾天甚至幾周，然而制作的動物模型只需要短短幾個(gè)小時(shí)或者幾天就可以表現(xiàn)出來[8]。Hubbard等[9]認(rèn)為理想的膿毒癥動物模型應(yīng)具備以下條件：膿毒癥動模型的血培養(yǎng)均為陽性；膿毒癥早期時(shí)表現(xiàn)為暖休克狀態(tài)，即高血容量和高代謝的特點(diǎn)，晚期表現(xiàn)為冷休克狀態(tài)，即低血容量和低代謝的特點(diǎn)；同時(shí)，動物模型最好既成本小，又要重復(fù)性好。

3 常用的膿毒癥動物模型

綜合近幾年文獻(xiàn)分析，常用的膿毒癥模型主要分為3大類：（1）細(xì)菌感染模型，如動物體內(nèi)注射活的病原體；（2）毒血癥模型，如向動物注射脂多糖等毒素；（3）宿主屏障破壞性模型，如盲腸結(jié)扎一穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）及升結(jié)腸支架植入腹膜炎 （colon ascendens stent peritonitis，CASP）模型。下面詳細(xì)介紹這三類常用的膿毒癥模型

3.1 細(xì)菌感染模型

細(xì)菌注射模型多通過靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)等不同途徑向動物注射活的病原體，引起局部和全身炎癥反應(yīng)來達(dá)到引發(fā)膿毒癥的臨床表現(xiàn)。通過使用已知菌落的活病原體可以在很大程度上控制菌血癥模型。輸注活病原體的方式主要包括3種：（1）小劑量一次性輸注；（2）小劑量持續(xù)輸注；（3）大劑量一次性輸注。利用這3種方式造模，都可以產(chǎn)生與膿毒癥相類似的炎癥反應(yīng)及血流動力學(xué)變化。Van等[3]研究認(rèn)為小劑量單次輸注對動物模型誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)較輕，器官功能損傷不是特別明顯，使得死亡率很低。此種造模方法不符合膿毒癥的臨床預(yù)后規(guī)律，多已不被采用，而大劑量一次性輸注會使動物模型的臟器過早衰竭及死亡；此種方式造模在血流動力學(xué)方面開始就表現(xiàn)為低排高阻，與膿毒癥早期的高排低阻則相反；一般還沒來得及啟動炎癥反應(yīng)機(jī)制時(shí)，動物模型就已經(jīng)死亡了。

小劑量持續(xù)輸注能模擬細(xì)菌從感染部位持續(xù)釋放入血的特點(diǎn)，讓動物模型有足夠的時(shí)間啟動炎癥反應(yīng)機(jī)制，使促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子（TNF）呈低水平升高，維持較長時(shí)間的高排低阻的血流動力學(xué)變化及高代謝狀態(tài)，產(chǎn)生與膿毒癥相似的病理生理狀態(tài)及臨床特征。Skorup等[10]利用這種方法向豬體內(nèi)小劑量持續(xù)輸注大腸桿菌，結(jié)果顯示，在G-導(dǎo)致的膿毒癥或休克的早期階段，聯(lián)合應(yīng)用內(nèi)酰胺類及氨基糖苷類抗生素可增強(qiáng)抗菌效果。然而，G+導(dǎo)致的感染在膿毒癥中所占的比例逐年增加，尤以金黃色葡萄球菌居多[9]。G+活化Toll樣受體2的主要成分是細(xì)菌脂蛋白（BLPs），通過活化核因子（NF）-KB 和 AP-1，促進(jìn)機(jī)體釋放炎癥因子；同時(shí)磷壁酸（LTA）利用Toll樣受體2減弱中性粒細(xì)胞表面的的CXCR2的表達(dá)，從而抑制中性粒細(xì)胞對細(xì)菌的清除，從而發(fā)生膿毒癥[11]。李倩等[12]研究表明臨床上膿毒癥后期多是G+和G-合并感染，從而加重了患者病情，也增加了治療難度。郭松喜等[13]通過微透析技術(shù)，分別研究正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位對藥物的回收率，推算出不同靶部位的藥物濃度，進(jìn)而也為臨床治療開辟了一條新的道路。

3.2 毒血癥模型

膿毒癥動物模型最早使用的就是毒血癥模型，20世紀(jì)90年代國外研究者發(fā)現(xiàn)了LPS結(jié)合蛋白（LBP），通過向動物體內(nèi)注射內(nèi)毒素—脂多糖（LPS）來誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥因子，進(jìn)而發(fā)展為全身的炎癥反應(yīng)，達(dá)到模擬人體膿毒癥炎癥反應(yīng)機(jī)制的效果[14]。理論上，直接靜脈輸注脂多糖就可以造模。但是，綜合文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于毒血癥的造模方式，根據(jù)向靜脈輸注的速度和單位量，也是分為小劑量一次性輸注、小劑量持續(xù)輸注和大劑量一次性輸注三種方式。Johannes等[15]認(rèn)為劑量的衡量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)以降低早期血壓和減少腎小球灌注為目標(biāo)。陳明祺等[16]通過靜脈小劑量持續(xù)輸注LPS，建立小鼠膿毒癥模型，為研究其炎癥反應(yīng)和免疫功能，分別于輸注LPS后的特定時(shí)間段測定血清中的炎癥介質(zhì)濃度，測定單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)水平，并留取腸粘膜組織標(biāo)本觀察病理改變情況。研究結(jié)果提示四逆湯可調(diào)節(jié)全身炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，促進(jìn)感染性小鼠腸黏膜、腸功能和免疫功能的修復(fù)。有國外研究報(bào)道，膿毒癥主要通過激活三條信號通路，介導(dǎo)適應(yīng)性免疫或產(chǎn)生放大的級聯(lián)反應(yīng)，觸發(fā)機(jī)體釋放大量的細(xì)胞因子和炎性神經(jīng)遞質(zhì)[17]，促使全身炎癥反應(yīng)綜合征及代償性抗炎反應(yīng)綜合征的發(fā)生，最終導(dǎo)致膿毒血癥。DOI等[14]認(rèn)為該模型并不能完全模仿人類膿毒血癥，注射脂多糖只是早期引起細(xì)胞因子劇增，而炎癥反應(yīng)消失非?？?，整個(gè)過程極其短暫。比如用抗腫瘤壞死因子和白介素-1治療注射脂多糖的動物模型，治療作用卻并不理想。

3.3 宿主屏障破壞性模型

宿主屏障破壞性模型是使機(jī)體的保護(hù)屏障遭到破壞，讓細(xì)菌和其他腸道內(nèi)容物漏出、移位。腹腔感染是膿毒癥患者最常見的感染源，且引起腹腔感染相對較容易，所以膿毒癥常用的動物模型就是腹腔感染模型。早期腹腔感染模型是在動物腹腔內(nèi)直接輸注稀釋的盲腸內(nèi)容物、帶有細(xì)菌的自體凝塊或大腸桿菌。而現(xiàn)在的造模方式主要包括盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）模型和升結(jié)腸支架植入腹膜炎 （colon ascendens stent peritonitis，CASP）模型。LI等[18]認(rèn)為盲腸結(jié)扎穿孔方法是評價(jià)膿毒癥動物模型的金標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)镃LP可以產(chǎn)生與人類膿毒癥十分相似的炎癥反應(yīng)。血流動力學(xué)變化、免疫反應(yīng)及生物化學(xué)的改變[8]。CASP模型比CLP模型產(chǎn)生的炎癥因子反應(yīng)更強(qiáng)及在血液的細(xì)菌數(shù)更多，此種模型主要用于研究彌漫性腹膜炎的病理生理特點(diǎn)和治療方案。

盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）模型：20世紀(jì)80年代Wichterman等把這種模型改良并推廣，是現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的模型。盲腸里存在糞便，把盲腸結(jié)扎穿孔，使含有細(xì)菌的糞便不斷進(jìn)入動物腹腔致其腹腔感染，從而模仿臨床上發(fā)生的腹膜炎及膿毒癥。在制作CLP模型過程中，我們可以根據(jù)感染程度的不同結(jié)扎盲腸的不同部位，這也是CLP模型的其中一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即能夠造成不同嚴(yán)重程度的膿毒癥[19]。Huber-Lang等[20]認(rèn)為雙阻斷白細(xì)胞分化抗原14（cluster of differentiation 14，CD14）和補(bǔ)體 C5（complement C5）比單獨(dú)阻斷CD14或補(bǔ)體C5可以很大程度上增加膿毒癥大鼠的生存率，因此，在以后的膿毒癥治療中，可以嘗試特定的阻斷CD14和補(bǔ)體C5，或許可以成為治療膿毒癥的一種新方法。到目前為止，臨床上也沒有可以明確診斷膿毒癥及判斷預(yù)后的敏感性或者特異性指標(biāo)[21]。最近國內(nèi)學(xué)者的一篇影響膿毒癥預(yù)后因素的多元Cox回歸模型分析表明，腸道術(shù)后、APACHEII評分、空腹血糖、HDL-C、BUN、Ca2+、LY、PLT和SOFA評分是影響膿毒癥患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[22]。國外有研究報(bào)道人參皂苷Rb1可以減輕膿毒癥大鼠肺及肝的損害，使其生存率得到明顯提高；其生理機(jī)制主要是通過改善動脈血壓、下調(diào)TLR4-mRNA的表達(dá)及阻止 TNF-α 的生成[23]。

升結(jié)腸支架植入腹膜炎（CASP）模型：由于CLP模型可以形成腹腔內(nèi)膿腫和膿毒癥兩種情況，但模型的壞死組織缺少像臨床上手術(shù)切除的干預(yù)方式，后來研究者通過建立CASP模型解決了這個(gè)問題。Traeger等[24]研究表明升結(jié)腸支架植入腹膜炎（CASP）模型的嚴(yán)重程度與腹腔內(nèi)放的支架的直徑及臟器功能衰竭進(jìn)程有關(guān)。升結(jié)腸支架植入腹膜炎（CASP）模型造成腹膜炎后會迅速發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)綜合征，隨后發(fā)生的CARS讓機(jī)體逐步進(jìn)入低炎癥反應(yīng)狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)大鼠模型的肝臟中存在IL-10表達(dá)較多，TNF量較少，而在大鼠的肺中則相反；可以推測它在很大程度上調(diào)控著機(jī)體的免疫反應(yīng)。BURAS等[25]研究發(fā)現(xiàn)臨床中膿毒癥患者的血漿IL-10、IL-6、TNF水平比CASP模型中明顯降低，表明全身炎癥反應(yīng)綜合征和代償性抗炎反應(yīng)綜合征可能在機(jī)體的不同部位同時(shí)發(fā)生。

4 展望

雖然膿毒癥動物模型的造模方式有多種，但是每一種膿毒癥模型都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，不能完全反應(yīng)人類機(jī)體膿毒癥的演變過程[26]。盡管如此，膿毒癥模型的研究在指導(dǎo)膿毒癥臨床治療中仍然發(fā)揮重要作用。由于膿毒癥病理機(jī)制十分復(fù)雜，為了對其有更詳細(xì)的認(rèn)知，要求我們在制作動物模型過程中，依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌欢ㄒ谧约旱难芯恐袠?biāo)注好這些明確因素。這樣不僅可以讓后期研究者得到有價(jià)值的信息，還可以讓膿毒癥動物模型的制作日趨完善。通過微透析技術(shù)研究正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位的回收率，推算出不同靶部位的藥物濃度，這或許為膿毒癥的研究提供了新思路。雙阻斷白細(xì)胞分化抗原14和補(bǔ)體C5可以使膿毒癥大鼠的生存率明顯提高，因此特異性的阻斷CD14和補(bǔ)體C5，是否也可以成為臨床上治療膿毒癥的一種新方法?希望以后制作的動物模型可以真實(shí)再現(xiàn)人類膿毒癥，從而解決膿毒癥臨床治療這一難題。