中性粒細胞性哮喘小鼠氣道炎癥和細胞因子的變化及意義

王永彬，安 文，吳 倩，馮菲菲，車曉文?

（1.山東大學第二醫院呼吸內科，山東 濟南 250033；2.山東省菏澤市巨野縣董官屯鎮衛生院，山東 菏澤 274900)

支氣管哮喘是氣道慢性炎癥性疾病。既往認為嗜酸性粒細胞氣道炎癥是哮喘典型的改變，TH1/TH2細胞失衡所致TH2細胞優勢是介導嗜酸細胞性哮喘發病最重要的免疫學機制。但隨著研究深入，顯示哮喘的氣道炎癥存在不同的亞型，可分為嗜酸細胞性哮喘和非嗜酸細胞性哮喘，其中半數以上的非嗜酸細胞性哮喘為中性粒細胞性哮喘[1]（Neutrophilic asthma，NA）。Thl7是一種以產生IL-17為主要細胞因子的輔助性T細胞，IL-17對于中性粒細胞參與的支氣管哮喘氣道炎癥、氣道高反應、氣道重塑均發揮重要作用[2]。本研究通過觀察NA小鼠肺組織病理改變、支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞及IL-17、IL-10水平的變化，探討TH17/Treg細胞失衡對NA小鼠氣道炎癥的影響及其免疫調節作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

20只實驗用C57BL/6雌性小鼠按隨機數字法分為NC組、NA組，每組10只，分籠飼養。

1.2 主要試劑與設備

OVA、LPS、乙酰甲膽堿均購自美國Sigma公司。小鼠IL-10、IL-17 ELISA試劑盒由杭州聯科生物技術有限公司提供。Emka動物肺功能測試系統購自法國。

1.3 實驗方法

1.3.1 NA小鼠模型建立

NA組于實驗第0、6、13天小鼠麻醉后予100 μgOVA及0.l μgLPS氣道滴入致敏。第21天起連續2周霧化1%OVA激發，每天1次，每次激發60分。

NC組則用生理鹽水代替LPS及OVA致敏及激發。

1.3.2 氣道反應性測定

末次OVA霧化激發后24h，按濃度0、1、2、4、8、16mg/ml依次吸入乙酰甲膽堿，并行無創肺功能檢測，記錄氣道反應性監測指標Penh（Enhanced pause）。

1.3.3 BALF的收集

于氣道反應性測定完畢后處死小鼠，夾閉右主支氣管，剪開氣管用相應導管插入左主氣管內，從導管注入0.3 mL生理鹽水灌洗左肺，反復3次，回收率為60%～70%。將 BALF4℃3000 r/min條件下離心10 min，回收細胞進行涂片并行瑞氏-姬姆薩染色，計數白細胞數量并分類。上清液保存于-80℃，用于細胞因子的測定。

1.3.4 肺組織切片HE染色

于收集BALF后剖取右肺固定于10%福爾馬林溶液內，常規取材，脫水，石蠟包埋，切片（4微米厚）、進行HE染色。

1.3.5 ELISA法測定細胞因子水平

收集BALF后按照ELISA檢測試劑盒的說明書，測定BALF中IL-17、IL-10含量。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 兩組小鼠哮喘癥狀

霧化激發過程中，NA組小鼠出現抓耳撓腮、煩躁不安、呼吸急促、毛色失去光澤、腹肌抽搐等，可聞及明顯的喘鳴音，而NC組未出現上述癥狀。

2.2 兩組小鼠氣道反應性測定

乙酰甲膽堿刺激小鼠，當乙酰甲膽堿濃度達16 mg/mL，NA組氣道反應性較NC組升高（P＜0.05）。見表1。

表1 乙酰甲膽堿刺激后兩組小鼠氣道反應性（±s，mg/m）

表1 乙酰甲膽堿刺激后兩組小鼠氣道反應性（±s，mg/m）

注：a與NC組比較P＜0.05

組別 n penh 0 1 2 4 8 16 NC組 10 0.95±0.26 1.52±0.47 1.94±0.41 2.43±0.71 2.72±1.10 3.04±0.83 NA組 10 1.04±0.05 1.59±0.56 2.35±1.10 3.69±0.90 4.62±0.78 5.11±0.92a

2.3 兩組小鼠BALF中細胞總數及細胞分類計數比較

NA組細胞總數，中性粒細胞（NEU）和嗜酸性粒細胞（EOS）計數均高于NC組、且NEU計數高于EOS計數（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組小鼠BALF中細胞總數及白細胞分類計數（±s，105/mL）

表2 兩組小鼠BALF中細胞總數及白細胞分類計數（±s，105/mL）

注：a與NC組比較P＜0.05；b與EOS計數P＜0.05

組別 n 細胞總數 NEU計數 EOS計數NC組 10 6.9±2.5 1.9±0.9 0.68±0.2 NA組 10 17.0±4.1a 10.1±2.2ab 1.72±0.7a

2.4 兩組小鼠肺組織病理改變

NC組肺組織細支氣管和肺泡結構清晰，基本無炎癥細胞浸潤；NA組支氣管及血管周圍大量炎癥細胞浸潤，且以中性粒細胞浸潤為主，肺泡壁、支氣管壁明顯增厚。見圖1。

注：A：NC組；B：NA組

2.5 兩組小鼠BALF中細胞因子IL-17、IL-10水平比較

NA組IL-17水平明顯升高、IL-10水平明顯降低，與NC組比較有明顯差異（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組小鼠BALF中細胞因子IL-17和IL-10水平（±s，pg/mL）

表3 兩組小鼠BALF中細胞因子IL-17和IL-10水平（±s，pg/mL）

注：a與NC組比較P＜0.05

組別 n IL-17 IL-10 NC組 10 41.6±7.5 118.f22.1 NA組 10 83.0±10.4a 31.5±7.2a

3 討 論

支氣管哮喘是最常見的慢性呼吸道疾病，近年研究證實支氣管哮喘具有明顯的異質性。過去研究顯示哮喘是一種由Th2細胞驅動的“嗜酸細胞性”炎癥疾病，近年的研究發現還存在除嗜酸性粒細胞哮喘外的其他炎癥表型，NA、寡細胞性和混合細胞性哮喘4種亞型。而不同的炎癥表型其發病機制不同。人們逐漸認識到非嗜酸細胞性氣道炎癥，特別是中性粒細胞性氣道炎癥在哮喘發病機制中的作用。我們在前人研究的基礎上[3]建立了NA小鼠模型，結果顯示，NA組小鼠表現為中性粒細胞浸潤為主的氣道炎癥及氣道高反應性。

支氣管哮喘發病機制與免疫功能紊亂有密切聯系，既往認為Th1/Th2細胞失衡是造成哮喘的免疫學發病基礎，近年來研究發現Th17和調節性T細胞（Treg）及其代表性細胞因子IL-17、IL-10在哮喘發病中起著重要作用[4]。IL-17、IL-10 能在一定程度上反映Th17、Treg細胞亞群的功能狀態，因而成為監測Th17/Treg 細胞功能的常用指標。IL-17具有強大的促炎和趨化免疫細胞的作用，IL-10是一種多功能負性調節因子，具有很強免疫抑制及免疫調控作用，是Treg發揮免疫調節作用的重要介質。Treg是一類具有免疫抑制作用的T細胞亞群，能負向調節免疫功能，能抑制輔助性T細胞亞群，從而防止過敏性疾病和自身免疫性疾病的發生[5]。哮喘的發作與IL-17、IL-10的水平相關，IL-17可能抑制了IL-10的產生，二者在功能上相互拮抗。本研究結果發現TH17細胞因子IL-17高于對照組，而Treg細胞因子IL-10低于對照組。

綜上所述，NA小鼠BALF中細胞因子IL-17、IL-10異常變化，表現為IL-10水平降低、IL-17水平升高，TH17/Treg平衡失常，此可能為引起NA小鼠氣道高反應性及氣道炎癥的原因。

[1]張毓嫻,農光民,廖 競,等.誘導痰液細胞學分析對兒童支氣管哮喘臨床分型中的應用.實用兒科臨床雜志,2010,25(2):129-132.

[2]Zhao Y,Yang J,Gao YD,et al.Th17 immunity in patients with allergic asthma.International Archives of Allergy &Immunology,2010,151:297-307.

[3]劉曉微,蔣 敏,農光民,等.中性粒細胞性支氣管哮喘小鼠模型的建立及其氣道高反應規律的研究.中華哮喘雜志:電子版,2013,7(3):151-158.

[4]龔 臣,鄧靜敏.Th17/Treg在支氣管哮喘發病機制中的作用及研究進展.中華哮喘雜志:電子版,2013,7(3):684-688.

[5]EusebioM,KunaP,Kraszula L, et al.The relative values of CD8+CD25+Foxp3brigh Treg cells correlate with selected lung function parameters in asthma.International Journal of Immunopathology & Pharmacology,2015,28:218-226.