電針對帕金森病模型大鼠黑質內Bip、CHOP蛋白表達的影響

馬駿,王中明,王述菊,余沛豪,王彬,王琪

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電針對帕金森病模型大鼠黑質內Bip、CHOP蛋白表達的影響

馬駿,王中明,王述菊,余沛豪,王彬,王琪

(湖北中醫藥大學,武漢 430065)

觀察電針對魚藤酮誘導的帕金森病(PD)模型大鼠黑質內質網應激相關蛋白表達的影響。將120只健康雄性SD大鼠隨機分正常組、假手術組、模型組、電針預治療組、電針治療7 d組、電針治療14 d組、電針治療21 d組、電針治療28 d組,每組15只,采用頸背部皮下注射魚藤酮法制備PD模型,假手術組只注射不含魚藤酮的等量葵花油乳化液。正常組、假手術組、模型組不做任何治療;電針治療組在造模完成后選取風府、太沖穴給予電針治療;電針預治療組電針治療7 d后再造模。運用免疫組化法檢測大鼠黑質內TH、a-syn的陽性表達,并用Western blot法檢測大鼠中腦黑質區內Bip、CHOP蛋白表達的變化。模型組大鼠表現出明顯的PD癥候群特征,電針干預后大鼠行為學評分明顯降低(＜0.01);與正常組和假手術組相比,模型組大鼠黑質區a-syn的陽性表達與Bip、CHOP蛋白的表達均顯著提高,大鼠黑質區TH的陽性表達均顯著降低 (＜0.01);與模型組相比,電針治療各組大鼠黑質區a-syn的陽性表達以及Bip、CHOP蛋白的表達均顯著降低 (＜0.01),大鼠黑質區TH的陽性表達顯著提高(＜0.01)。電針防治PD的機制可能與電針能明顯抑制內質網應激相關蛋白的表達,保護多巴胺能神經元有關。

針刺療法;帕金森病;電針;內質網應激;免疫球蛋白重鏈結合蛋白;CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白;大鼠

帕金森病(Parkinson’s disease, PD),又稱震顫麻痹,是中老年常見的一種以黑質紋狀體通路功能減退為主要特征的神經退行性疾病,其主要的臨床癥狀為肌肉僵直、四肢震顫、運動遲緩以及步態不穩。病理表現為黑質致密區多巴胺神經元變性壞死伴胞漿內嗜酸性包涵體--路易小體(1ewy body, LB)的形成路易小體的主要成分是a-突觸核蛋白(a-synuclein,a-syn)[1-2]。a-syn異常聚集可引起內質網應激。PD的發病原因尚未完全明了,相關研究表明,氧化應激、線粒體功能障礙、泛素蛋白酶系統損傷、異常蛋白沉積等均與PD發病有關。內質應激是細胞凋亡的重要途徑之一,相關研究表明內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)在PD發病過程起重要作用[3]。內質網分子伴侶免疫球蛋白重鏈結合蛋白(binding immunoglobulin heavy chain protein, Bip)和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer- binding protein homologous protein, CHOP)是ERS的兩個經典標志物,GRP78表達上調可減輕ER蛋白負荷,對細胞起保護作用,而CHOP表達上調則激活細胞死亡,啟動細胞凋亡途徑[4-5]。本研究通過觀察電針對PD模型大鼠Bip及凋亡因子CHOP的影響,探討電針治療PD的可能作用機制,旨在為PD發病機制及治療靶點研究提供一定的理論基礎,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗選用SPF級健康雄性SD大鼠120只,體重(180±20)g,由武漢大學實驗動物中心提供,許可證號[SCXK(鄂)2014-0004]。所有動物均在通風良好的條件下分籠飼養,自由攝食及飲水。隨機分為正常組、假手術組、模型組、電針預治療組、電針治療7 d組、電針治療14 d組、電針治療21 d組、電針治療28 d組,每組15只。

1.2 主要試劑及儀器

魚藤酮、葵花油(購于Sigma公司);兔抗Bip(武漢三鷹生物技術有限公司,11587-1-AP);兔抗CHOP(santa cruz,sc-575);顯影定影試劑盒(武漢巴菲爾生物技術有限公司);丙烯酰胺(Amresco公司);電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司,CPA);電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);微量移液器(北京六一儀器廠,DYY-7C);垂直電泳槽(北京六一儀器廠,DYCZ-24DN);電轉儀(北京六一儀器廠,DYCZ-40);水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司,TS-1);X光膠片(柯達,XBT-1);0.30 mm×13 mm不銹鋼毫針(北京中研太和醫療器械有限公司);G6805電針治療儀(青島鑫升實業有限公司)。

1.3 動物模型制備及鑒定

所有大鼠適應環境1星期后,采用頸背部皮下注射魚藤酮法制備PD大鼠模型[6-7],模型組和電針治療組給予魚藤酮(2 mg/kg,溶解于葵花油,濃度2 mg/mL)頸背部皮下注射,每日1次,連續28 d;正常組不做任何處理;假手術組方法同模型組,但只注射不含魚藤酮的等量葵花油乳化液(溶劑);電針預治療組先對正常大鼠電針治療7 d,然后造模。

造模后觀察大鼠的行為學改變,參照陳忻等[8]的行為學評分標準,對各組大鼠進行評分。評分標準如下,1分為大鼠出現拒捕行為減弱、弓背、豎毛、毛發變黃變臟、主動活動減少;2分為有1分的表現,且主動活動減少更加明顯,并伴有震顫、動作遲緩、或有步態不穩;4分為有2分的表現,且步態不穩,或不能直線行走、或行走時向一側旋轉;6分為向單側斜臥,單側前肢或后肢癱瘓,行走困難,進食困難;8分為單側肢體(前肢或后肢)完全癱瘓,四肢拘攣,體重大幅減輕,不能進食;10分為瀕死狀態或死亡。本研究在行為學評分達2～8分的大鼠中隨機抽取6只大鼠以TH免疫組織化學技術作組織學鑒定。

1.4 電針干預方法

大鼠造模成功后,給電針治療各組大鼠穿上自制的鼠衣固定,參照余曙光等[9]主編的《實驗針灸學》中大鼠常用的針灸穴位,取風府、太沖穴進行電針治療。用0.30 mm×13 mm不銹鋼針灸針,進針約4 mm,然后接G6805電針治療儀,正極接風府穴,負極接太沖穴,采用連續波,刺激強度以大鼠腿部輕微抽動為度。每只大鼠治療20 min,每日1次。正常組、假手術組、模型組大鼠每日在相同時間抓取固定,但不給予電針治療,各組動物同步喂養。

1.5 標本采集

造模完成后,排除死亡、行為學評分不合格(評分＜2分或＞8分)的大鼠,每組均有12只納入標本采集。將大鼠稱重后用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉,劑量為0.2 mL/100 g。各組大鼠隨機選取6只行左心室多聚甲醛做內固定,取大鼠中腦黑質部組織塊,并用4%多聚甲醛固定過夜,作石蠟包埋切片,用于形態學觀察。另外6只大鼠待其完全麻醉后快速斷頭,于冰面上迅速取出腦組織并分離出中腦黑質組塊,將分離的黑質組塊用錫紙包裹放入液氮中速凍,然后取出組織放置在凍存管中于-80℃冰箱中保存,以備檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 黑質TH、a-syn的陽性表達

采用免疫組化法檢測黑質TH、a-syn的陽性表達。將上述切片進行常規脫蠟處理,切片依次放入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-95%乙醇-90%乙醇-80%乙醇-70%乙醇,然后入蒸餾水浸泡2 min。采用微波進行抗原修復;用蒸餾水新鮮配置的3%H2O2滴加于切片組織上以阻斷內源性過氧化物酶,PBS沖洗3次,每次3 min;加一抗于4℃濕盒中孵育過夜;加二抗,37℃孵育20 min,PBS沖洗切片3次,每次3 min;加DAB顯色液,Harris蘇木素復染,然后脫水,封片,在顯微鏡下觀察,采集圖像。

1.6.2 BIP、CHOP蛋白的表達

采用免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測BIP、CHOP蛋白的表達。取-80℃冰箱中冷凍保存的黑質組塊,加入RIPA裂解液勻漿5 min,于4℃溫度下,轉速12000 r/min,離心30 min后,取上清液。用Bradford法測定蛋白濃度后,各個待檢測樣品取50mg的總蛋白,上樣后PAGE凝膠電泳,根據各待檢樣品分子量的不同,BIP用8%的PAGE膠,CHOP用10%的PAGE膠。轉膜(濕轉法),轉膜條件,BIP采用200 mA,120 min; CHOP采用300 mA,150 min。封閉用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜,室溫搖床封閉2 h。用封閉液稀釋相應的一抗(BIP采用1:300稀釋,CHOP采用1:200稀釋),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4℃孵育過夜。然后孵育二抗,用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗(1:50000稀釋),使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中,室溫搖床孵育2 h。顯色曝光,TBST充分洗滌PVDF膜5～6次,每次5 min。每張膜滴加適量的ECL底物液,孵育數分鐘。待熒光帶明顯后,用濾紙吸去多余的底物液,覆上保鮮膜,X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。采用BandScan軟件對目標圖像進行灰度分析,得出BIP、CHOP與b-action的相對吸光度值,并進行統計學分析。

1.7 統計學方法

所有數據采用SPSS17.0軟件進行數據處理,計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用-分析,繼用-檢驗。以＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學評分比較

表1 各組大鼠行為學評分比較 (±s,分)

注:與正常組、假手術組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

造模完成后,排除死亡、行為學評分不合格(評分＜2分或＞8分)的大鼠,每組均有12只納入檢測統計。行為學評分結果顯示,模型組大鼠評分較正常組和假手術組明顯升高(＜0.01),電針治療組和電針預治療組大鼠評分較模型組顯著降低(＜0.01),提示經魚藤酮造模后的PD大鼠模型可出現明顯的行為學改變,而通過電針干預能夠明顯改善其PD癥狀。詳見表1。

2.2 各組大鼠黑質TH、a-syn平均光密度比較

使用IPP6.0軟件對免疫組化照片進行光密度分析,每張切片選取3張400倍照片,計算其平均光密度進行比較分析。結果顯示,與正常組和假手術相比,模型組大鼠黑質區TH陽性表達顯著降低(＜0.01),a-syn陽性表達顯著升高(＜0.01);與模型組相比,電針預治療組和電針治療7 d、14 d、21 d、28 d組大鼠黑質區TH陽性表達顯著升高(＜0.01),a-syn陽性表達顯著減少(＜0.01)。正常組和假手術組大鼠黑質TH、a-syn陽性表達水平未見明顯差異(＞0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠黑質內TH、a-syn平均光密度比較 (±s)

注:與正常組、假手術組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.3 各組大鼠黑質內BIP、CHOP蛋白表達比較

表3 各組大鼠黑質內BIP、CHOP蛋白表達比較 (±s)

注:與正常組、假手術組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

注:1為正常組;2為假手術組;3為模型組;4為電針預治療組;5為電針治療7 d組;6為電針治療14 d組;7為電針治療 21 d組;8為電針治療28 d組

Western blot檢測結果顯示,模型組中腦黑質BIP、CHOP蛋白表達較正常組和假手術組顯著增高,差異具有統計學意義(＜0.01)。與模型組相比,電針預治療組和電針治療7 d、14 d、21 d、28 d組BIP和CHOP蛋白表達水平顯著降低(＜0.01)。正常組和假手術組BIP、CHOP蛋白表達水平未見明顯差異(＞0.05)。詳見表3、圖1。

3 討論

帕金森病是中老年人常見的一種中樞神經系統退行性疾病,雖然目前PD的發病機制尚不完全清楚,但大量研究結果表明PD是環境因素和遺傳因素共同作用的結果。其典型的病理特征是中腦黑質致密部DA能神經元的變性缺失與殘余神經元內嗜酸性包涵體LB的形成。TH是DA合成過程中的限速酶,其在黑質紋狀體系統中的質量與DA能神經元密切相關,因此TH可以反映DA能神經元的狀況[10]。LB的主要成分是a-syn,研究發現黑質神經元中a-syn蛋白的聚集與沉淀參與了PD的病理過程[1]。正常情況下a-syn的存在形式是可溶性的,它可以經過細胞自身的降解方式而清除,而PD患者黑質神經元中由于異常折疊或未折疊而聚集和沉淀的a-syn蛋白是不可溶的,因此也很難降解。這些異常的a-syn聚集過多時就會損壞內質網內環境的穩態,引起ERS[2]。

BIP是內質網分子伴侶蛋白,在輔助蛋白質加工合成、調節內質網應激信號中扮演著重要的角色。在一般生理情況下,BIP與內質網跨膜蛋白結合在一起,使它們處于失活狀態。當各種因素誘發ERS時,BIP便會與跨膜蛋解離優先與內質網內集聚的錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白結合以幫助新合成蛋白的正確折疊,減輕內質網負荷,試圖恢復內質網穩態。當ERS過強或持續時間過長,內質網穩態無法恢復時,細胞就會啟動凋亡程序,促使細胞凋亡[4-5]。CHOP是內質網相關促凋亡蛋白,在正常細胞中表達很低,但在ERS時被大量誘導表達,激活細胞凋亡途徑[11-13]。CHOP廣泛表達于哺乳動物機體細胞,其編碼的蛋白與多種細胞功能活動(如增殖、分化、凋亡等)相關。Ji C等[14]通過灌喂乙醇實驗發現,CHOP缺失型小鼠的肝細胞凋亡現象與野生型小鼠相比明顯減少,另外一些與凋亡相關的基因也出現了變化,如CHOP野生型小鼠中下調的Jun D與Bc-l xl和Gadd45的上調。所有這些都證明CHOP基因在ER應激誘導細胞凋亡中具有重要作用,通過檢測 CHOP蛋白表達的變化可以直觀判斷細胞凋亡的程度。

PD屬中醫學“顫證”范疇,中醫學認為此證為本虛標實之證,以肝腎虧虛,髓海不足為本,實以風、火、痰、瘀為標。本病患者以中老年人居多,概因中老年患者年老體衰,肝腎不足,髓海空虛,不能濡養四肢所致。故“筋脈失養,風氣內動”是本病的基本病機,治療宜采取滋補肝腎,填精益髓,柔肝舒筋,祛風止顫之法。《素問·至真要大論》:“諸暴強直,皆屬于風”“諸風掉眩,皆屬于肝”。因此,本實驗取風府與太沖相伍。風府歸屬督脈,為治療內風之要穴,誠如《行針指要賦》:“或針風,先向風府。”且督脈為十二經脈之海,總督一身陽氣,督脈從風府穴處入屬于腦,故針刺風府不僅可以直達病所,祛風止顫,還有填精益髓之妙。太沖歸屬足厥陰肝經,為肝經之原穴,自古肝腎同源,故針刺太沖可有滋補肝腎、柔肝舒筋之效。

現在西藥治療PD主要以左旋多巴類藥物為主,其短期療效明顯,但長期應用不僅療效減弱,且毒副反應明顯[15]。反觀針灸在改善PD的運動癥狀、延緩病情進展、減輕藥物的毒副反應、提高患者的生存質量方面有一定的優勢[16]。本課題組在前期研究中發現電針可以保護PD模型大鼠中腦黑質神經元,抑制星型膠質細胞的活化,改善泛素-蛋白酶體系統功能,減輕谷氨酸釋放引起的細胞毒作用,降低中腦黑質區炎性介質的表達[17-20]。本實驗選用頸背部皮下注射魚藤酮的方法制作PD模型,由于該模型能夠選擇性地引起黑質DA能神經元變性死亡和復制胞質內路易小體,因而較之MPTP等模型更好地模擬了PD的行為和病理特征[21]。本實驗結果顯示,模型組大鼠黑質內a-syn陽性神經元數量與BIP、CHOP蛋白的表達較正常組和假手術組顯著增高,TH陽性神經元數量顯著降低,說明在PD的發病過程中存在ERS相關信號的激活,并引起了DA能神經元的損傷。而在經過電針干預后,黑質內a-syn陽性神經元數量與BIP、CHOP蛋白的表達水平均顯著降低,TH陽性神經元數量顯著提高,說明電針風府、太沖穴可以有效抑制ERS相關蛋白的活性,保護DA能神經元。因此,電針防治PD的機制可能與電針能明顯抑制ERS相關蛋白的表達,保護DA能神經元免于凋亡有關。

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Effect of Electroacupuncture on BiP and CHOP Expressions in the Substantia Nigra in a Rat Model of Parkinson Disease

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,430065,

To investigate the effect of electroacupuncture on the expressions of endoplasmic reticulum stress-related proteins in the substantia nigra in a rat model of rotenone-induced Parkinson disease.One hundred and twenty healthy male SD rats were randomized to normal, sham operation, model, electroacupuncture pretreatment, and 7-day, 14-day, 21-day and 28-day electroacupuncture treatment groups, 15 rats each. A model of Parkinson disease was made by subcutaneous injection of rotenone in the nape. The sham operation group received an injection of equal volume of sunflower oil emulsion. The normal, sham operation and model groups were not treated. The electroacupuncture treatment group received electroacupuncture at points Fengfu (GV 16)and Taichong (LR 3) after model making. The electroacupuncture pretreatment group received model making after 7 days of electroacupuncture treatment. TH anda-syn positive cells expressions in rat substantia nigra were determined by immunohistochemical method. BiP and CHOP expressions in rat substantia nigra were examined by Western blotting.The model group rats had obvious syndrome characteristic of PD and rat behavior score decreased significantly after electroacupuncture intervention (＜0.01).a-syn positive cells expression and BiP and CHOP expressions in rat substantia nigra increased significantly and TH positive cells expression in rat substantia nigra decreased significantly in the model group compare with the normal and sham operation groups (＜0.01).a-syn positive cells expression and BiP and CHOP expressions in rat substantia nigra decreased significantly and TH positive cells expression in rat substantia nigra increased significantly in every electroacupuncture treatment group compare with the model group (＜0.01).The mechanism of electroacupuncture prevention and treatment of Parkinson disease may be related to its significant inhibition of the expressions of endoplasmic reticulum stress-related proteins and protection of dopaminergic neurons.

Acupuncture therapy; Parkinson disease; Electroacupuncture; Endoplasmic reticulum stress; Immunoglobulin heavy chain binding protein; CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein; Rats

1005-0957(2018)01-0086-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.01.0086

國家自然科學基金項目(81473788,81403456);湖北省武漢市科學技術局高新技術產業科技創新團隊計劃項目(2014072704021262)

馬駿(1964—),女,教授,博士,研究方向為針灸防治腦病及神經系統疾病的研究,Email:mj-1964@163.com

王述菊(1977－),女,教授,博士,研究方向為針灸防治腦病及神經系統疾病的研究,Email:361786273@qq.com

2017-08-21