納米磁珠核酸自動提取儀在手足口病病毒檢測的臨床應用價值研究

黃偉 ，冉飛 ，余楊紅 ，謝玉珍 ，段榮 ，柯江維

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由多種腸道病毒(Enterovirus，EV)引起的，腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CAl6)是最主要的病原體[1-4]，以發熱和手、足、口腔、咽部等部位出現皰疹或者潰瘍為主要特征，是一種兒童常見的全球性傳染病，嚴重時可引發中樞神經系統(CNS)并發癥，甚至導致重癥患兒死亡，其中EV71病毒是重癥手足口病最主要的病原體[5，6]。實時熒光定量PCR為目前臨床早期診斷實驗室檢測的主要方法[7，8]，其特點不僅檢測快速，而且具有高度靈敏度和高特異性，并且可同時檢測EV71、CA16和腸道病毒通用型，對手足口病腸道病毒病原體檢測實現全覆蓋[9]。Fang Y等[10]通過mata分析得出，首次就醫的確診能顯著降低重癥手足口病的風險。由此可見，如何提高手足口病實驗室病原學的診斷效率，尤其是提高腸道病毒（CoxA16、EV71等）特異性核酸檢測陽性的靈敏度、準確性，對疾病的治療、預防和控制有著及其重要的作用。而能否提取出高質量的核酸則是實時熒光定量PCR檢測的關鍵，提取方法的靈敏度、特異性也將直接關系到后續試驗的成敗。目前很多公司紛紛推出自己的全核酸自動提取儀器，各種原理的都有，本文將對西安天隆NP968自動核酸提取儀 (磁珠法)和手工法在手足口病腸道病毒咽拭子標本前處理的比較，評價納米磁珠核酸自動提取儀在手足口病腸道病毒RNA熒光定量PCR檢測中的應用價值，為納米磁珠核酸自動提取儀在手足口病腸道病毒核酸提取中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 96例咽拭子樣本均來源為我院2016年6月份門診手足口病疑似患兒 （根據衛生部《手足口病診療指南（2010 年版）》[11]診斷），發病年齡0～5歲，性別、體重、營養狀況未統計。

1.2 RNA 提取方法

1.2.1 樣本處理及實驗分組 將生理鹽水2～4ml加入無菌咽拭子管中，振蕩混勻，備用。實驗分為兩個組：⑴核酸提取儀組：加入100μl咽拭子樣本混勻液至天隆核酸提取試劑盒。⑵Trizol提取組：加入100μl咽拭子樣本混勻液至Trizol和氯仿中。

1.2.2 NP968核酸提取儀提取法 天隆 NP968核酸提取儀利用磁珠吸附原理，從病毒樣本中提取手足口病腸道病毒RNA。按照說明書操作，試劑配制、加樣（在96孔板的第1及第7排中分別加入30μl Proteinase K、100μl樣品及 4μl Acryl Carrier），運行自動化程序(預先根據說明書設定裂解/結合/洗滌/洗脫/棄磁珠的時間和反應體積及溫度)，自動化程序結束后將第6及第l2排的洗脫液轉移至干凈EP管中。

1.2.3 Trizol提取法 將咽拭子樣本混勻液 100μl加入Trizol和氯仿中，吹打靜置3min，12000r/min離心2min；樣品即分成水樣層、中間層和有機層，收集水樣層通過SiO2沉淀RNA來還原，離心取沉淀加入75%乙醇液洗滌，離心沉淀，60°C加熱干燥，加入30μl DEPC水混勻，待用。

1.3 實時熒光 PCR擴增 反應體系 20μl如下：RNase Inhibitor 1μl，5xReverse Transcriptase Buffer 4μl，OL68-1 Primer 1μl，dNTP Mixture(l0mM each)1μl，MMLV Reverse Transcriptase 1μl，樣品 RNA 1μl，DEPC 水 11μl。

循環條件設置如下：40℃ 25min，1個循環；94℃ 3min，1 個循環；93℃ 15s，55℃ 45s，40 個循環。設置完成后，保存文件，運行程序。根據CT值判定結果：CT值≥38為陰性，CT值＜35為陽性，35≥CT值＜38為檢測灰區，亦判定為陽性結果。

1.4 統計學分析 計量資料以均數±標準差 （x±s）表示，采用配對t檢驗或兩獨立樣本t檢驗比較，計數資料的比較采用χ2檢驗。應用SPSS 16.0統計軟件進行分析，使用GraphPad Prism 5.0進行制圖，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 稀釋法檢測手足口病腸道病毒兩種方法提取的陽性檢出率 我們隨機抽取96例門診疑似手足口病標本，使用兩種方法同時進行檢測，實驗結果顯示，NP968核酸提取與手工提取法陽性檢出率二者差異無統計學意義 （P>0.05），兩者檢出率見表1；隨后用無菌生理鹽水做103倍稀釋，稀釋后NP968核酸提取儀陽性檢出率更高，有統計學意義(46.9%vs 39.6%，P=0.016)，見表 2。

表1 兩種方法檢查手足口病的檢出率（n=96）

表2 稀釋后兩種方法的檢測結果

2.2 比較兩種提取的批內精密度及重復性 從手足口病腸道病毒陽性樣本中各取一份低CT值（強陽性）和高CT值（弱陽性）標本，分別用自動核酸提取法和手工法每組連續測定10次所得結果經兩獨立樣本T檢驗統計分析批內精密度，結果顯示患兒手足口病腸道病毒在高CT值（弱陽性）組，NP968核酸自動提取較Trizol法提取精密度高，有統計學意義(36.70±0.17 vs 37.40±0.23，P<0.05)，而低CT值（強陽性）組，二者無明顯差異（21.40±0.16 vs 21.40±0.26，P>0.05），見圖 1A；隨后，從手足口病腸道病毒陽性樣本高CT值（弱陽性）組隨機抽取10份陽性標本，平行重復做3次計算CT值的平均值，測算兩種提取方法的變異系數，經配對T檢驗結果顯示NP968核酸提取儀法重復性較手工Trizol提取法好（36.39±0.27 vs 36.68±0.38，CV 0.74%vs 1.04%），見圖 1B。

圖1 兩種提取方法批內精密度及重復性的比較

3 討論

本課題研究表明NP968核酸提儀在手足口病腸道病毒RNA提取陽性檢出率、精密度、重復性等方面均優于Trizol手工法。值得一提的是，本次實驗研究中，我們發現隨著樣本稀釋倍數的增加導致手工提取的陰性檢出率增加、陽性檢出率減小，表明全自動核酸提儀靈敏度高于手工提取法，因而全自動核酸提取儀可以為臨床診斷手足口病腸道病毒濃度更低的樣本提供更有價值的幫助；此外，手工提取的陰性檢出率增加還可能是因為手工提取法核酸提取處理時間較長，操作較為煩鎖，周圍環境中廣泛存在的RNA酶能快速降解病毒RNA，造成標本假陰性結果。

目前，我們沒有進行交叉污染率的相關性研究，雖然全自動核酸提取儀在陽性檢出率、精密度、重復性方面具有優勢，但由于儀器內的氣溶膠、儀器程序運行錯誤以及儀器中磁力棒的污染是一個值得考慮的問題，這是一個導致對陰性標本交叉污染的潛在問題。相比全自動核酸提取儀提取手足口病腸道病毒RNA病毒，傳統手工提取一個潛在的擔憂是手工提取效果主要依賴檢驗技術人員的技術嫻熟度。另外，本文對納米磁珠法和Trizol法提取手足口病腸道病毒進行對比，納米磁珠法與手工提取法陽性檢出率分別為55.2%和54.2%，其手工提取法陽性檢出率和江西省內其他醫院基本相同[12]。本課題研究未進行EV71與CA16病毒分組提取陽性診斷率的比較，我們認為全自動核酸提取儀與手工法提取在不同類型的手足口病腸道病毒提取中其靈敏度和特異性有可能存在差異，因此有必要對EV71和CA16兩種病毒提取進行方法學上的進一步研究。此外，其他實際問題如標本處理速度、人力成本已有文獻報道[13]，故本實驗室不再進行研究分析。

總之，納米磁珠核酸自動提取儀在手足口病腸道病毒核酸提取中的應用有利于應對手足口病流行季節或爆發流行時大批量標本的處理，降低勞動強度，實現手足口病標本的高效、快速、準確地處理。同時，提高實驗室生物安全防護水平，保障醫務工作者的職業衛生與安全，保障醫療質量和醫療安全有著極其重要的作用和意義。