ABO血型基因測序在正反定型不符血型鑒定中應用

徐晶

ABO血型系統(tǒng)是臨床輸血領域最為重要的一個血型系統(tǒng)，由于等位基因在遺傳過程中伴隨的突變現(xiàn)象，導致了所表達血型抗原的復雜性和多樣性，呈現(xiàn)出多種變異的型別[1-3]。ABO血型鑒定傳統(tǒng)的血清學方法包括正反定型試驗、吸收放散試驗和唾液血型物質(zhì)中和抑制試驗，近年來基因?qū)W方法在ABO疑難血型中應用得到廣泛重視。本實驗室采用血清學方法和基因測序法對ABO血型正反定型不符病例1例進行血型鑒定，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 患者資料 某患者，男，13歲，因右肘骨折后伴細菌感染入院，欲行手術治療。術前備血時，發(fā)現(xiàn)其ABO血型正定型A型，反定型為AB型。既往體健，無輸血史。為明確血型，遂將其血樣標本送至我科做進一步鑒定。

1.2 試劑 單克隆抗-A、抗-B（批號20150101）、抗-AB血 清 （批 號 446000）、 抗-H （批 號20150616）、ABO 試劑紅細胞（批號 20165319）均為上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司生產(chǎn)；人源抗-B血清 （本室自制）；DNA抽提試劑盒（PROMEGA，USA），PCR 產(chǎn) 物 純 化 試 劑 盒 （MILLIPORE，Ireland），BigDye Terminator v3.1 循 環(huán) 測 序 試 劑 盒（Applied Biosystems，USA），ABI9700 型 PCR 儀（美國Applied Biosystems公司）；凝膠電泳儀（Bio-Rad公司），ABI3130XL基因測序分析儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 血型血清學實驗 患者的ABO血型正、反定型采用試管法進行；不規(guī)則抗體篩選實驗分別采用鹽水介質(zhì)、聚凝胺介質(zhì)、抗人球蛋白介質(zhì)中進行；采用人源血清進行吸收實驗、采用熱放散對吸收人源血清的紅細胞進行放散；唾液血型物質(zhì)檢測采用中和抑制試驗。所有操作按美國血庫協(xié)會操作手冊進行[4]。

1.4 基因組DNA提取 用DNA提取試劑盒抽提患者血樣標本的基因組DNA，所有操作均嚴格按照試劑說明書進行。

1.5 擴增ABO基因外顯子6、7和直接測序 參照文獻報道的方法進行[5]。

2 結果

2.1 血清學實驗 患者的ABO血型正定型為A型，反定型為AB型。4℃增強后，反定型B細胞出現(xiàn)2+的凝集，與抗H反應室溫出現(xiàn)2+的凝集反應，4℃增強后為3+（表1）；唾液中檢出A、H血型物質(zhì)；吸收放散實驗表明患者紅細胞可吸收放散人源抗-A。

2.2 ABO基因第6、7外顯子測序 測序結果顯示，外顯子6 c.261G未發(fā)生缺失，c.297A未發(fā)生點突變，外顯子7存在c.467C>A的雜合點突變（圖1）。

3 討論

自Yamamato F等[6]克隆出ABO基因的cDNA序列以來，ABO血型的鑒定除了常規(guī)血清學方法外，逐步有了分子生物學方法作為補充，截止目前，在人類血型基因突變庫記載的等位基因已經(jīng)達到了380個[7]，這充分說明了ABO等位基因豐富的多態(tài)性。等位基因序列多態(tài)性的存在，導致了ABO血型抗原表達的差異，最終表現(xiàn)為各種亞型。因此，在常規(guī)血清學實驗檢測的基礎上，輔以測序等技術有利于精準鑒定ABO亞型。

圖1 患者ABO基因第外顯子6和7測序結果

本結果中，患者的血清學正、反定型不相符，正定型為A型，反定型則為AB型。唾液中檢出A、H血型物質(zhì)；吸收放散實驗表明患者紅細胞可吸收放散人源抗-A。綜合分析其血清學實驗結果，ABO血型應當定型為A型，伴抗體減弱/消失。

測序結果表明，外顯子6 c.261G未發(fā)生缺失，c.297A未發(fā)生點突變，外顯子7存在c.467C>A的雜合點突變，對比血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫，該位點為ABO*A102的特異性突變位點，可以得出，該患者的基因型為A102/A101，測序結果與血清學綜合分析得出的鑒定結果相符。

本病例中，患者基因型對應的抗原表達沒有出現(xiàn)異常，但抗體水平出現(xiàn)了異常。曾經(jīng)有國外學者報道過類似案例[8-10]，影響抗體水平表達的機制是該突變位點的單獨作用還是聯(lián)合了別的突變位點，則有待進一步的研究探索。

臨床輸血實踐中，正確的ABO血型鑒定至關重要。血型鑒定錯誤而導致血液誤輸注，則可能發(fā)生嚴重的輸血反應。因此，一旦發(fā)現(xiàn)血清學定型正、反定型不相符，建議進一步完善檢測方法。包括血清學中的吸收放散實驗、檢測血型物質(zhì)的中和抑制實驗等。在有條件的單位，建議進行分子生物學方法的補充，包括PCR-SSP，測序等途徑，盡量避免血型鑒定錯誤的發(fā)生，從而保證輸血安全。