新余市甲型流感病毒M基因進化及金剛烷胺類耐藥性分析

付倩 ，文奇 ，周銀古 ，劉琴 ，宋利軍 ，熊英 ，李建雄

流感病毒屬于正黏病毒科的單負鏈RNA病毒，按照核蛋白抗原的不同可分為甲、乙、丙三型，其中以甲型流感病毒危害最大，曾經引起至少4起世界流感大流行[1]。甲型流感病毒基因組由8個節段組成，其中第7個節段為M基因，編碼M蛋白。M蛋白是除血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)外第3種跨膜蛋白[2]，可分為M1、M2蛋白，分別在穩定病毒包膜機構、構成離子通道功能方面發揮重要作用。本文通過對新余市2013年-2015年甲型流感病毒M基因進行測序分析，獲取甲型流感病毒M基因進化以及烷胺類藥物耐藥性等信息。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集流感監測哨點醫院流感樣病例和疑似流感暴發疫情病例的咽拭子標本。

1.2 病毒分離 采用狗腎傳代細胞（MDCK）進行病毒分離，根據細胞病變和微量血凝試驗（HA）來判斷病毒是否存在，將HA≥1：8的標本采用血凝抑制試驗 （HAI）進行流感病毒型別鑒定，MDCK細胞、標準抗血清分別由江西省疾控中心、國家流感中心提供。

1.3 毒株選擇 隨機選擇新余市2013年-2015年分離到的甲型流感毒株，進行基因擴增和測序，其中新型H1N1病毒14株、H3N2病毒16株，所有毒株均經國家流感中心復核鑒定。

1.4 RNA提取 按照QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit試劑盒（Cat.No：74106，Lot No：145022097）操作說明書，從流感毒株中提取病毒核酸。

1.5 M基因擴增 采用QIAGEN公司的One Step RT-PCR Kit 試 劑 盒 (Cat.No：210212，Lot No：145030642)進行RT-PCR反應，引物及反應條件[3]：F1：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCA GGTAG-3′，R1027：5′-CAGGAAACAGCTATGACC AGTAGMAACAAGGTAGT-3′， 逆轉錄 60℃ 1min，42℃ 10min，50℃ 30min；熱啟動 95℃ 15min；循環94℃ 40s，50℃ 40s，72℃ 1min，35 次 ； 保 溫 72℃10min，在BIO-RAD PTC-200儀器上進行擴增。

1.6 序列測定和分析 RT-PCR產物交于上海生工生物工程技術服務有限公司純化和雙向測序。序列分析利用DNAstar中Seqman軟件對雙向序列進行拼接、MegAlign軟件進行同源性分析，以及Mega5.0中 Clustal W 方法進行序列比對、Neighbor-joining法構建進化樹。選取烷胺類藥物敏感株A/NewYork/55/2004（H3N2）以及 2010 年～2015 年北半球疫苗推薦株 A/California/07/2009(H1N1)、2012年～2014年北半球疫苗推薦株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、2014年～2015年北半球疫苗推薦株A/Texas/50/2012(H3N2)作為參考毒株，從GenBank下載M基因序列，收錄號分別為CY121126、CY121681、KJ942681、KC892961。

2 結果

2.1 M基因核苷酸序列進化分析 30株甲型流感病毒的M基因雙向序列經拼接均獲得長度約為1000bp的核苷酸序列，對其構建進化樹（圖1），M基因核苷酸序列進化樹分為H3N2和新型H1N1二大分支。H3N2大分支上，烷胺類藥物敏感株A/NewYork/55/2004（H3N2）為一分支，16 株 H3N2 病毒與 疫 苗株 A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)構成另一分支；新型H1N1大分支上，14株新型H1N1病毒形成一個分支，疫苗株A/California/07/2009(H1N1)為另一分支。16株H3N2病毒與藥物敏感株 A/NewYork/55/2004（H3N2）、疫苗 株 A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)相比較，核苷酸序列相似性分別在97.8%～98.2%、99.6%～100%、99.4%～99.8%；14 株新 H1N1病毒與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比較，相似性為 98.4%～99.2%；16 株 H3N2 病毒之間、14株新型 H1N1病毒之間相似性分別為 99.2%～100%、98.8%～100%。

圖1 M基因核苷酸序列進化樹

2.2 M2蛋白氨基酸序列分析 M2基因核苷酸編碼序列為M基因前26bp和中后部268bp的組合序列，由核苷酸序列推導出M2蛋白氨基酸序列（圖2），它由97個氨基酸所組成。與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比較，14株新型 H1N1病毒均發生D21G突變，A/JiangxiYushui/SWL1220/2014(H1)存在另一個突變T65M；與烷胺類藥物敏感株 A/NewYork/55/2004（H3N2）相比較，疫苗株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)和新余市分離的16株H3N2病毒均存在S31N、N88D替換；與疫苗株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)相比較，除了 A/JiangxiYushui/1100/2014(H3)發生V28A突變、A/JiangxiFenyi/515/2014(H3)發生 Y52H和 G89N突變、A/JiangxiYushui/525/2015(H3)發生 G89N突變外，新余市其它13株H3N2病毒均未發生變異。

2.3 烷胺類藥物耐藥性位點分析 與烷胺類藥物敏感株A/NewYork/55/2004（H3N2）相比較，疫苗株A/California/07/2009 (H1N1)、A/Vitoria/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)和 新 余 30 株 甲 型流感病毒均發生了S31N的氨基酸替換。

圖2 M2基因氨基酸序列位點分析

3 討論

疫苗是預防流感最有效的方法，但疫苗的有效性必須與流行株相匹配[6]。而新疫苗的研制總是滯后于流感的流行，因此抗病毒藥物成為應對流感的必要手段。烷胺類藥物是最早投入使用的抗流感藥物，如金剛烷胺和金剛乙胺[10-12]。M2蛋白位于流感病毒包膜上，結構上分為胞外區、跨膜區和胞漿區，其中跨膜區通過二硫鍵使其N’端第25～43位氨基酸形成管狀四聚體 （離子出入通道），在流感病毒感染過程中發揮著重要作用：一是隨著病毒在胞飲過程中形成內涵體，M2蛋白被激活開放離子通道，氫離子內流導致病毒內酸化，使病毒核酸與病毒衣殼的結合減弱而易于進入宿主細胞；二是在病毒脫出宿主細胞時保護病毒HA蛋白構象不發生因適酸化引起的不可逆變化，有利于病毒顆粒的裝配、釋放[7]。烷胺類藥物與M2蛋白離子通道結合，抑制離子通道阻斷氫離子內流，從而抑制病毒復制。流感病毒極易對烷胺類藥物產生耐藥突變，耐藥株的產生與M2蛋白上構成通道離子的氨基酸位點改變有關，現已證實L26F、V27A、A30T、S31N、G34E位中的氨基酸只要有1個或1個以上的變異就會導致耐藥株的出現[8]。從烷胺類藥物上市以來就不斷有流感耐藥株的報道，美國疾病預防控制中心（CDC）在1992年至2005年間分離的H3N2流感病毒中具有烷胺類藥物抗性的比例從0.3%急劇上升至92.3%，而全球分離到的烷胺類抗性毒株98%以上都攜帶S31N突變，且隨后在2008年至2009年流感的監測報告中公布了3000多株流感毒株藥敏試驗結果，其中季節性H3N2和新H1N1對烷胺類耐藥率已達到100%[9]。國內學者對1989年-2005年中國分離到的H3N2毒株抽樣后進行耐藥性檢測，結果表明1989年-1999年未檢測到烷胺類藥物抗性毒株，2000年之后耐藥比例逐漸上升，至2005年已經達到77.6%[4]。在江西省內部分地區流感病毒耐藥性情況已見報道[13-15]，但有關新余市流感病毒的耐藥性研究此前尚未展開。分析新余市流感病毒M基因進化情況，推導出M2蛋白氨基酸序列，就可以了解新余當地流行株是否產生耐藥性突變。

分析新余市2013年至2015年甲型流感病毒M基因進化情況可以發現，30株流行株與相應的疫苗推薦株高度同源但M基因仍不斷進化，變異程度隨時間跨度有緩慢增加的趨勢。從M2蛋白97個氨基酸位點變異來看，與相應的疫苗株相比較，16株H3N2病毒中除了A/JiangxiYushui/1100/2014 (H3)、A/JiangxiFenyi/515/2014(H3)、A/Jiangxi Yushui/525/2015(H3)這3株涉及1～2個位點突變外，其余13株病毒均未發生變異，較穩定，而14株新H1N1病毒均發生1～2個氨基酸替換；M2蛋白跨膜區第25～43位氨基酸是烷胺類藥物的作用靶位，對影響烷胺類藥物敏感的26、27、30、31和34位氨基酸進行分析[4]。新余市30株甲型流感病毒M2蛋白跨膜區第31位氨基酸均由絲氨酸(S)突變為天冬酰胺(N)，與江西省南昌市的監測結果相同[3，5]；，全部對烷胺類藥物產生耐藥，烷胺類藥物已經不能作為流感的預防和治療用藥，建議對流感病毒耐藥性問題加以重視。