南昌地區(qū)無償捐獻者血小板基因頻率調(diào)查分析

張曉麗，杜忻

血小板抗原（HPA）是由血小板膜糖蛋白攜帶的一類特異性抗原，是由遺傳決定的。HPA的基因頻率在不同種族，不同區(qū)域中的分布是不同的。在臨床血小板輸注過程中，如果血小板同種抗原不相匹配，可導(dǎo)致受血者機體產(chǎn)生血小板同種抗體，引起同種免疫血小板減少綜合癥，輸血后紫癜，血小板輸注無效等[1]。因此，血站擁有一些血小板同種抗原分型的血小板供者，在臨床輸血應(yīng)用中具有重要意義。我們采用PCR-SSP方法，對南昌地區(qū)158例無償血小板捐獻者的HPA1-6，9，15共8個抗原系統(tǒng)16個等位基因進行分型，對其基因及基因型頻率和不配合率進行統(tǒng)計分析并與不同人群中的分布進行對比，同時建立南昌地區(qū)無償血小板捐獻者HPA基因資料庫，為解決臨床問題打下堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 南昌市血站收集158例無血緣關(guān)系，固定的無償血小板捐獻者血樣3ml/人（份），EDTA抗凝。

1.2 儀器設(shè)備與試劑 PCR擴增儀（SimpliAmp）；凝膠成像 （G：BOX F3）； 電泳裝置 （Dyy-2C）；HPA1-6，9，15等位基因序列特異性引物 （innotrain有效期內(nèi)使用）Taq酶 （Promega有效期內(nèi)使用）；DNA提取試劑盒（inno-train有效期內(nèi)使用）。

1.3 實驗方法 血樣DNA提取按DNA提取試劑盒說明書操作，HPA分型方法采用PCR-SSP技術(shù)。

1.4 PCR 擴增 取 1.5ml的 Eppendof管， 加入水120μl，PCR 反應(yīng)緩沖液 60μl，然后加入 DNA 樣品20μl（濃度大約 50ng/μl）Taq 酶 1.6μl（5unit/μl），將上述混合液在振蕩器上徹底混勻20s，取混合液10μl于PCR反應(yīng)板上，貼好封板膜或蓋好PCR管蓋，離心機短暫離心，將PCR擴增儀預(yù)熱到94°C，放入PCR板或PCR管，按94°C 2min 1個循環(huán)，94°C 20s，70°C 60s 5 個循環(huán)，94°C 20s，65°C 60s 72°C 45s 10 個循環(huán)，94°C 20s，61°C 50s 72°C 45s 20個循環(huán)，72°C 5min循環(huán)參數(shù)擴增。

1.5 PCR產(chǎn)物檢測 擴增結(jié)束后取5μl PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳20～25min，全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，拍照記錄。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析方法 采用χ2檢驗對每個HPA系統(tǒng)的等位基因a，b進行H-W平衡檢驗，3種基因型 aa，ab，bb 的頻率為 faa，fab，fbb，令等位基因 a 的頻率為p， 等位基因b的頻率為q， 則p=faa+，fab，/2，q=，fbb，+，fab/2；aa 基因型期望值為 np2，ab 基因型期望值為2npq，bb基因型期望值為nq2，將觀察值（O）與期望值，（C）按公式（O－C）2/C 進行 χ2檢驗，比較二者之間差異，P＞0.05即表明可以接受基因頻率符合H－W遺傳平衡定律，血小板隨機輸注不配合率[2]。 MP=a2（1-a2）+b2（1-b2）=2ab(1-ab)，a，b 分別代表a和b基因頻率。見表1、表2。

2 結(jié)果

2.1 HPA1-6，9，15等位基因分型結(jié)果 以獻血碼為0150216000198樣本為例，圖1。

圖1 樣本0150216000198HPA1-6，9，15基因分型結(jié)果

2.2 基因型和等位基因頻率分布 通過統(tǒng)計和計算，得到158例血小板無償捐獻者HPA1-6，9，15基因型和等位基因頻率。見表1。

2.3 不同地區(qū)、不同種族人群HPA基因頻率和不配合率比較 見表2。

3 討論

血小板抗原分為兩類：一類是血小板與其他細胞或組織共有的抗原，稱為非特異性抗原；另一類是血小板特異性抗原，存在于血小板膜糖蛋白上，是構(gòu)成血小板膜結(jié)構(gòu)的一部分，即人類血小板抗原，血小板特異性抗原具有遺傳多態(tài)性。

我們發(fā)現(xiàn)南昌地區(qū)無償血小板捐獻者HPA-1a，-2a，-4a，-5a，-6a，-9a 是最常見的等位基因，HPA-1a，-9a呈單態(tài)性分布。除HPA-3，-15系統(tǒng)外，其余系統(tǒng)均未檢出b/b純合子。HPA-3，-15系統(tǒng)最具多態(tài)性，并存在aa，ab，bb3種表現(xiàn)型。HPA-1，-4系統(tǒng)南昌與南京、海南相同，都是aa純合子；HPA-9系統(tǒng)南昌與南京、廣州、成都、海南、長沙都是aa純合子。HPA-2系統(tǒng)南昌與海南相比較，有顯著性差異(P<0.05)；其它系統(tǒng)南昌與南京、廣州、成都、海南、長沙基因頻率比較均無顯著性差異（P>0.05)。

表1 158例無償血小板捐獻者HPA1-6，9，15系統(tǒng)基因頻率分布（n=158）

南昌與不同國家HPA基因頻率比較：HPA-1，-2，-5基因頻率與美國黑人比較有顯著性差異；HPA-1，-5與英國白人有顯著性差異；與日本無顯著性差異。

在隨機血小板輸注中，HPAa/b抗原不配合幾率的高低，反映了HPA抗原在輸血治療時刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生血小板同種抗體幾率的大小，即HPA不配合率比例越高，產(chǎn)生同種抗體的機會越多，血小板輸注時要重視系統(tǒng)的配合。血站建立血小板供者庫存，臨床對受者進行HPA分型，對提高血小板的輸注效果具有重要意義。

在不配合率中可見，南京HPA-2系統(tǒng)較國內(nèi)其它地區(qū)高，MP為0.1388，其它地區(qū)均小于0.1，南昌地區(qū)HPA-3和HPA-15系統(tǒng)的不配合率分別為0.3714和0.3749，近年來的國內(nèi)外研究資料表明，HPA-3和HPA-15系統(tǒng)為引起血小板同種免疫的常見系統(tǒng)之一[4，9-12]。

HPA-1，-2，-5系統(tǒng)英國白人和美國黑人的不配合率相比于中國人較高 (國內(nèi)南京HPA-2系統(tǒng)不配合率也高)，日本人中HPA-2，-4，-5系統(tǒng)的不配合率較中國人高，證明不同種族間遺傳背景不同，導(dǎo)致有臨床意義的HPA系統(tǒng)不配合率高低也不同。

HPA導(dǎo)致的血小板同種免疫與血小板輸注無效、輸血后紫癜、新生兒同種免疫性血小板紫癜、特發(fā)性血小板減少性紫癜疾病相關(guān)，血小板輸注無效是指患者在輸注合適劑量的血小板后沒有產(chǎn)生“適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)”，即連續(xù)兩次輸注足量隨機供者血小板后，沒有達到合適的校正血小板計數(shù)增加值 （CCI)，臨床出血表現(xiàn)亦未見改善。大約30%～85%長期輸注血小板的患者，2%～11%會產(chǎn)生HPA抗體[13]；引起血小板輸注無效，2.7%由HPA抗體導(dǎo)致[14]。輸血后紫癜是指輸注血小板后引起急性、暫時性的同種免疫性血小板減少綜合癥，原因是出現(xiàn)血小板特異性同種抗體。新生兒同種免疫性血小板紫癜是妊娠期間由于母嬰間血小板不合，胎兒血小板抗原刺激母體產(chǎn)生相關(guān)抗體，通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，導(dǎo)致胎兒和新生兒血小板減少。特發(fā)性血小板減少性紫癜是由于患者自身免疫系統(tǒng)失衡，體內(nèi)產(chǎn)生針對自身血小板相關(guān)抗原的抗體，導(dǎo)致血小板大量破壞，引起免疫性血小板減少。針對這些由HPA引起的免疫性疾病患者，需要輸血時，最有效的手段就是輸注HPA配合的血液成分。因此，血站建立HPA基因資料庫非常有必要！

表2 不同區(qū)域和不同種族基因頻率和不配合率比較[3]-[8]