全自動生化分析儀法測定紅細胞脆性的性能研究及在地中海貧血篩查中的應用

馮志剛，梁愛芬，雷亞利，華仙麗，隋洪

地中海貧血是人類最常見的單基因遺傳病之一，全世界約有1億以上人口攜帶地貧基因[1，2]。我國南方尤其海南、貴州、廣西、云南、廣東、江西等地區為高發區[3-7]。由于地中海貧血基因攜帶者的臨床表型有很高的異質性，因此基因診斷才是地中海貧血確診的金標準[8-11]。2012年國家衛生計生委啟動實施地貧防控試點項目，2012年1月至2015年9月，試點地區共為54.13萬對新婚和計劃懷孕夫婦免費提供地貧篩查和基因檢測。鑒于各地區技術和經濟發展的不平衡性，作為地貧的篩查指標，紅細胞參數、紅細胞滲透脆性試驗、血紅蛋白電泳等簡便經濟的實驗室檢測項目，仍發揮著其不可或缺的作用[12-18]。市面上在售的紅細胞脆性檢測試劑盒（自動生化分析儀法）數量不多，且提供的多為通用參數，未指定儀器型號。本文使用武漢市長立生物技術有限責任公司生產的紅細胞脆性(EFT)測定試劑盒(直接比色法)結合SIEMENS公司的ADVIA 2400生化分析儀，建立了一種操作簡便、準確快速、成本低廉，且可進一步實現自動化分析的地貧篩查方法，研究其方法學參數并驗證臨床性能，供廣大的臨床實驗室同行和臨床醫生參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 ⑴SIEMENS公司生產的ADVIA 2400全自動生化分析儀。武漢市長立生物技術有限責任公司生產的紅細胞脆性 (EFT)測定試劑盒(直接比色法)，注冊證編號鄂械注準20142401475，組成自動生化分析儀檢測法，通過檢測反應體系中紅細胞懸液的濁度變化來計算溶血百分比。⑵上海精密科學儀器有限公司棱光722N可見分光光度計，配套廣州市米基醫療器械有限公司生產的紅細胞滲透脆性檢測試劑盒(一管法)，粵食藥監械(準)字2013第2400503號，組成手工法溶血百分比檢測法，通過檢測反應體系中游離血紅蛋白的光密度變化來計算溶血百分比。

1.2 自動生化分析儀檢測法參數優化

1.2.1 波長的選擇 ADVIA2400生化分析儀為光柵后分光，可以提供 340nm，410nm，451nm，478nm，505nm，545nm，571nm，596nm，658nm，694nm，751nm，805nm，845nm，884nm等14個波長的數據，根據反應原理，分別用生理鹽水和長立試劑中的溶血劑作用于相同量的全血，測定不同波長下的光密度系列值，選擇濁度變化明顯而血紅蛋白光密度背景低的波長作為檢測波長。

1.2.2 樣本體積分數的確定 為了降低透光率讀數誤差的影響，固定試劑體積為100μl，樣本為40μl全血加入到960μl生理鹽水中制備成上機檢測紅細胞懸液，在方法學參數設置界面依次設定樣本量 14μl、7μl、3.5μl，并分別對應增加生化分析儀機內生理鹽水樣本稀釋液體積保證反應總體積一致，進行紅細胞脆性平行檢測來優化加入反應杯中的稀釋樣本量。

1.3 方法學性能

1.3.1 重復性 在確定自動生化分析儀檢測紅細胞脆性試驗參數后，選擇正常與病理標本各1份，分別重復測定紅細胞脆性各10次，計算均值、標準差和變異系數，評估批內精密度，與試劑說明書中廠商聲明標準比較。

1.3.2 方法學比對 收集2016年4月我院門診、住院患者靜脈血標本共計99例，其中病例組14例（經深圳益生堂生物企業有限公司地中海貧血基因檢測試劑盒檢測基因型確診）， 年齡 27.2±8.3歲；對照組 85 例，年齡 25.8±10.4 歲。

使用廣州陽普醫療科技股份有限公司生產的EDTA·K2管抗凝真空采血管，抽取靜脈血2ml，收到標本后保存在2～8℃冰箱，分別使用武漢長立和廣州米基方法24h內檢測。計算出溶血百分比數值分別與兩者試劑說明書參考區間比較，判斷脆性試驗陰陽性，并以基因型為準的臨床診斷為金標準。

1.3.3 統計學分析 使用SPSS 19.0軟件進行統計學處理和分析，定量資料的比較使用t檢驗，定性資料的比較使用卡方檢驗，一致性檢驗使用Kappa檢驗。

2 結果

2.1 波長的選擇 從ADVIA 2400全自動生化分析儀獲得原始光密度數據，比較不同波長處紅細胞懸液、游離血紅蛋白溶液光密度。340nm，410nm，451nm，478nm，505nm，545nm，571nm，596nm，658nm，694nm，751nm，805nm，845nm，884nm 處紅細胞懸液 的 光 密 度 依 次 為 1.26734，1.73038，1.249 15，1.12029，1.08021，1.19975，1.02064，0.97956，0.97159，0.95745，0.95100，0.94740，0.94309，0.9421 1；游離血紅蛋白溶液的光密度依次為0.87212，2.62122，0.48450，0.24424，0.18837，0.401 93，0.43583，0.05860，0.02476，0.02230，0.02081，0.02067，0.02082，0.02054，將數據制成圖 1，可以看出，在596nm波長附近，游離血紅蛋白溶液光密度已遠遠小于紅細胞懸液的光密度，因此選擇596nm波長作為檢測波長。

2.2 樣本體積分數的確定 為了降低透光率讀數誤差的影響，分光光度法檢測技術一般選擇透光率 0.2～0.7 的讀數范圍， 已知 ADVIA 2400 的比色杯光徑為0.5cm，表2中顯示的讀數為標化成1cm光徑的讀數，所以選擇表中透光度0.339797對應的樣本量7μl。見表2。

圖1 紅細胞懸液、游離血紅蛋白溶液的光密度和波長關系圖

表2 ADVIA 2400生化分析儀樣本量與反應體系光密度透光率

2.3 批內精密度結果 評估標準為試劑說明書中廠商聲明標準，結論為符合廠商聲明標準。見表3。

表3 正常與病理標本溶血百分比精密度與廠商標準比較

2.4 兩種方法診斷一致性Kappa檢驗結果 對長立和米基兩種方法的診斷一致性進行Kappa檢驗，Kappa值為0.54，結論為兩者一致性中等。見表4。

表4 兩種方法診斷一致性Kappa檢驗結果

2.5 方法學的性能指標 以臨床診斷為金標準，兩種方法學的性能指標如表5，可見長立方法的敏感度略高，但特異度低于米基方法。

3 討論

正常紅細胞的形態為雙凹圓盤形，試驗時置于低滲性氯化鈉溶液中，水分子在細胞內外滲透壓差的條件下進入紅細胞，紅細胞發生腫脹甚至破裂而發生不完全或完全溶血，這種紅細胞在低滲鹽溶液中出現溶血的特性即紅細胞滲透脆性。滲透脆性升高可見于遺傳性球形紅細胞增多癥、遺傳性橢圓形紅細胞增多癥、自身免疫性溶血性貧血、阻塞性黃疸等疾病，減低可見于各型珠蛋白生成障礙性貧血、HbC、HbD、HbE血紅蛋白病、缺鐵性貧血、脾切除術等情況，近年來其臨床應用范圍不斷得到拓展[19]。臨床上基于此原理建立和應用的實驗方法有紅細胞滲透脆性過篩實驗、紅細胞滲透脆型簡易初篩實驗，紅細胞滲透脆性實驗光電比色法，紅細胞孵育滲透脆性實驗，紅細胞滲透脆性檢測一管法等，其中以紅細胞滲透脆性檢測一管法操作較為簡單，在我國南方地中海貧血高發區域廣泛的應用于該疾病的初篩。隨著實驗室高度自動化信息化的發展，以上多數方法固有的手工操作，步驟繁瑣，效率偏低，結果重復性差的缺點日益凸顯。國內有些廠家開發出應用于全自動生化分析儀檢測的試劑盒，僅提供少數品牌和型號生化分析儀的方法學參數和性能指標，且對其實驗原理闡述不深。本文根據紅細胞滲透脆性現象的的基本實驗原理，挖掘分析SIEMENSADVIA2400生化分析儀提供的多波長，全反應時間讀點的光學檢測數據，優化針對該全自動生化分析儀的方法學參數，并對儀器法和手工法的方法學性能比較做了初步的分析比較。

表5 兩種結果與臨床診斷結果的符合情況

本實驗結果表明，全自動生化分析儀法測定紅細胞脆性法，高值水平重復性1.6%，低值水平重復性3.4%，符合廠商標準，接近許多臨床化學常規項目。長立法敏感度、特異度分別為85.7%、77.6%，米基法分別為78.6%、94.1%，在臨床應用于地中海貧血篩查方面長立法具有一定的優勢。潘干華[20]所報道的兩點比濁法測定紅細胞脆性半自動生化儀法篩查地中海貧血的敏感度、特異度分別為86.3%，95.5%，本文全自動生化儀方法在操作上具有較大優勢，在靈敏度方面與其相當，在特異度方面與其尚有差距，分析可能為本文研究對象數量相對較少，擬在今后的臨床工作中不斷積累相關數據進行更深入的研究。綜上所述，全自動生化分析儀法在方法學性能和臨床性能方面均能滿足地中海貧血篩查的需要，宜在廣大地中海貧血流行地區大力推廣。