多發性骨髓瘤本周氏蛋白檢測及其臨床意義

黃國賢，顏綿生

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種起源于B細胞的漿細胞異常增生的惡性腫瘤，發病年齡大多在50～60歲之間，40歲以下較少見，男女之比為3：2[1]。而目前隨著人口老齡化以及檢測技術不斷提高，MM的發病率不斷增加，盡管不斷有新的藥物及治療方法應用于MM的治療中，但到目前為止MM仍被認為是不可治愈的[2]。

MM是由于單一株漿細胞異常增值，因而產生大量理化性質十分均一的免疫球蛋白，此蛋白稱為單克隆蛋白 （monoclonal protein，M蛋白），M蛋白大多無免疫活性，所以又稱副蛋白。M蛋白可以是免疫球蛋白的任何一類，也可以是κ或λ輕鏈中的任何一型。根據M蛋白的成分可將MM分為不同的類型，其中IgG型約占50%，IgA型約占25%，IgM型約占1%，IgE型和IgD型罕見，輕鏈型約占 20%[3，4]。

本周氏蛋白（Bence-Jones protein，BJP）即是游離免疫球蛋白輕鏈，分為 κ(Kappa)、λ(Lambda)2個型別。正常個體每天產生約500mg輕鏈，合成的輕鏈除了跟重鏈形成完整的Ig分子外，將近40%的輕鏈是游離的[5]，因此可以通過游離輕鏈(free light chain，FLC)的檢測方法檢測到。但是，常規的血清蛋白電泳技術（serum protein electrophoresis，SPE），甚至免疫固定電泳技術 （immunofixation electrophoresis，IFE）由于檢出低限閾值較高，采用上述檢測方法一般無法檢出正常人血清FLC[6]。由于B細胞發育過程中κ輕鏈基因重排具有優先性，所以正常人體內攜帶κ輕鏈免疫球蛋白的成熟B細胞多于攜帶λ輕鏈免疫球蛋白的成熟B細胞，此外，游離λ鏈較κ鏈更易通過二硫鍵形成二聚體，而后者則通常保持單體狀態，且κ濾過速率比λ二聚體快將近3倍。雖然κ型輕鏈總量約為λ型輕鏈的2倍，但是最終導致血清中游離型κ/λ的比例低于 2[7]。

目前輔助MM診斷的檢測技術有熱沉淀法、血清蛋白電泳 （serum protein electrophoresis，SPE）技術和免疫固定電泳（immunofixation electrophoresis，IFE）技術。SPE的基本原理是蛋白質在給定的pH條件下主要根據其所帶電荷數不同將其分離，形成 5 個不同遷移率區帶（Alb、α1、α2、β、γ），具有一定的敏感性和特異性，因此成為臨床上初步篩查M蛋白的首選技術。然而，SPE是一種半定量技術，其最低檢測M蛋白的濃度是0.13g/L，當M蛋白不出現r區時，易被其它蛋白掩蓋。IFE的基本原理是血清區帶電泳與免疫沉淀反應結合的一項定性實驗，血清先行區帶電泳后，分別在電泳條帶加上不同類型的抗體，相應的抗原將與抗體在某一區帶形成抗原抗體復合物，經漂洗和染色可清晰地顯示出抗原抗體反應帶。與SPE相比，IFE的敏感性和特異性明顯提高，其M蛋白的最低檢測濃度為100～150mg/L[8]，而且可對M蛋白進行進一步的分型，特別是在SPE電泳結果似是而非時，該技術有著明顯的優越性。因此，至今IFE在鑒定M蛋白方面仍屬首選的技術，尤其在鑒定含重鏈或重鏈片斷的M蛋白時尚無其他技術可以替代。然而，非分泌型MM、游離輕鏈型MM、淀粉性樣變疾病及經過治療后的MM，由于其產生少量的M蛋白，SPE和IFE難以檢測出來。而且，SPE和IFE在臨床使用繁瑣，尤其是IFE，不僅耗時、費力，且對設備和人員的要求較高，并且這兩種方法均不是定量的方法，因此在監測病情方面無法進行量化。

近年來開發出針對輕鏈“隱藏區”表位(輕鏈通過二硫鍵與重鏈結合的恒定區表位)的檢測試劑，該試劑作為抗體只與FLC結合，而不與完整的Ig上的輕鏈結合，因此敏感性高，特異性強，能檢測正常人 FLC 水平，敏感度達到 2～4mg/L[8，9]。 與常用的M蛋白檢測方法相比，此方法檢測sFLC除高度敏感性和特異性外，還具有檢測快速、方便、易于自動化等優點，是一種定量的檢測方法，其對MM的早期診斷、鑒別診斷、療效評估和病情監測等具有不可替代的優勢。但是其檢測閾值較低，無法區分游離輕鏈是否為單克隆，在協助MM診斷上存在一定的假陽性和假陰性，而且其試劑價格昂貴，因此尚未于臨床診斷廣泛開展[10]。

本研究是收集尿本周氏蛋白電泳陽性的MM患者血清和尿液標本，然后采用散射免疫比濁法檢測MM患者的血清和尿液總輕鏈 (游離κ+結合的κ或游離的λ＋結合的λ)并計算κ/λ的比值，還結合免疫球蛋白定量（IgG、IgA、IgM）、血清蛋白電泳、血清及尿液本周氏蛋白電泳的檢測，探討本周氏蛋白（游離免疫球蛋白輕鏈）檢測在MM診斷中的臨床意義。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選取 33例標本均選自2013年 3月－20016年10月在我院住院尿本周氏蛋白電泳陽性的 MM 患者，年齡 36～79 歲，平均年齡 56±11.4 歲，其中男性17例，女性16例，所有患者均符合文獻MM診斷標準[11]。

對照標本分為兩組，第一組為19例尿蛋白異常(尿白蛋白＞30mg/L)的非MM病人尿標本，其中腎病綜合征女性患者3例、男性患者4例，糖尿病腎病女性患者患者2例、男性患者3例，急性淋巴瘤女性患者2例、男性患者2例，SLE女性患者3例，年齡 29～78 歲，平均年齡 50.6±13.1 歲；38 例尿蛋白正常的非MM病人尿標本，女性15例，男性23 例，年齡 14～71 歲，平均年齡 49.6±13.6 歲。第二組為43例非MM病人的血清對照標本，女性18例，男性 25 例，年齡 15～85 歲，平均年齡 49.2±19.1歲。兩組對照標本人群的年齡、性別等相關因素均與 33例 MM 患者相仿，無統計學差異（P＞0.05）。

1.1.2 標本采集 MM患者和對照組病人于清晨空腹留取靜脈血6ml，促凝管保存，標本要求無脂血、溶血，3500rm/min離心5min，吸取上層血清分別移至1個1.5ml EP管，－70℃冰箱放置備用，同時期留取患者尿液標本 （晨尿），然后移至1個1.5ml EP管，－70℃冰箱放置備用。

1.1.3 主要儀器及試劑 采用法國 Sebia公司的Hydrasys全自動電泳儀，及其配套試劑包括瓊脂糖凝膠，樣本稀釋液緩沖液，抗IgG、IgA、IgM抗體，抗IgGAM混合抗體，抗 κ、λ抗體、抗游離 κ、游離 λ抗體，酸紫液，試劑批號15048101；美國德靈公司的BN II和BN Prospec全自動特定蛋白分析儀及其配套試劑盒，試劑批號為12258B。

1.2 方法

1.2.1 血清蛋白電泳 取患者血清10μl按要求點于Sebia配套加樣梳上，經瓊脂凝糖膠電泳后，烘干、染色、再褪色、烘干。然后通過光密度掃描，觀察M蛋白成分的含量。

1.2.2 血清免疫固定電泳 取患者血清 （加在抗IgG條帶的血清標本進行6倍稀釋）10μl按要求點于Sebia配套加樣梳上，經瓊脂凝糖膠電泳后，在每份標本的6條區帶依次加固定液40μl，抗IgG、IgA、IgM，抗 κ、抗 λ 試劑各 25μl，孵育 5min 以固定并沉淀蛋白。烘干、染色、再褪色、烘干，完畢后觀察結果。

1.2.3 血清和尿液本周氏蛋白電泳 患者血清用(尿液不用稀釋)稀釋液進行4倍稀釋后，取10μl稀釋血清按要求點于Sebia配套加樣梳上，經瓊脂凝糖膠電泳后，在每份標本的6條區帶依次加固定液 40μl，抗 IgGAM，抗 κ、抗 λ、抗游離 κ、抗游離λ 試劑各 25μl，孵育 5min（尿液 10min）以固定并沉淀蛋白。烘干、染色、再褪色、烘干。完畢后觀察結果，如果抗IgGAM陰性，抗κ或抗λ區帶陽性，且在同一位置抗游離κ或抗游離λ區帶陽性，則判斷本周氏蛋白電泳陽性。

1.2.4 血清總輕鏈（κ、λ）的測定 血清輕鏈測定應用散射免疫比濁法，其抗體是通過高純度人免疫球蛋白κ、λ輕鏈在兔子身上免疫反應而制備的，結合于輕鏈的非結合區，所測定數值包括了游離輕鏈值及與重鏈相結合的輕鏈數值，為總血清輕鏈數值。具體要求按BN-II全自動特定蛋白分析儀說明操作。

1.2.5 血清免疫球蛋白定量測定 血清免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）的測定應用散射免疫比濁法，采用的抗體是通過高純度人免疫球蛋白IgG、IgA、IgM在兔子身上免疫反應而制備。具體要求按BN-II全自動特定蛋白分析儀相關要求操作。

1.2.6 尿微量免疫球蛋白定量測定 尿微量免疫球蛋白（κ、λ、IgG、白蛋白）的測定應用散射免疫比濁法，其采用的抗體與血免疫球蛋白測定是一致的。具體要求按BN-Prospec全自動特定蛋白分析儀相關要求操作

1.2.7 統計學分析 所得的數據資料采用SPSS 15.0統計軟件進行Mann-Whitney U檢驗，P<0.01表示有統計學意義

2 結果

2.1 33例MM患者的電泳結果

2.1.1 血清蛋白電泳的結果 血清蛋白電泳見圖1，對M蛋白的判斷通過二人檢驗結果確定，陽性率為79%。4例輕鏈型MM患者（見圖1的6、16、23、28區帶）、2例 IgA 型 （見圖 1的 2、32區帶）、1例IgG（見圖1的21區帶）的電泳區帶上看不到明顯的M蛋白帶。電泳區帶1、5、27是IgA-λ型，4、9、25 是 IgA-κ 型；電泳區帶 3、7、12、15、17、18、22是 IgG-λ 型 ，8、10、11、13、14、19、24、26、29、30、31、33是 IgG-κ 型。

圖1 33例MM患者血清蛋白電泳圖譜

2.1.2 免疫固定電泳結果 33例MM患者血清蛋白電泳、血清免疫固定電泳、血清本周氏蛋白電泳、尿本周氏蛋白電泳結果見表1。血清免疫固定電泳對輕鏈型的MM結果難以判段，只能懷疑可能出現游離的輕鏈或者應用IgE型和IgD的抗體進一步應用免疫固定電泳確診，由于該兩型罕見，目前成本昂貴。而進行血本周氏蛋白電泳結果陽性率雖然只有30%，但4例輕鏈型的MM陽性率為100%，由于血清樣本相對干擾比尿液小，其配合血清免疫固定電泳可明顯有助于對常見MM病人進行確診。

表1 33例MM患者四種電泳結果數據統計

2.2 尿蛋白定量結果 33例MM患者、19例尿蛋白異常的非MM病人（腎病病人）和38例尿蛋白正常的非MM病人的尿白蛋白、尿IgG、尿κ、尿λ的濃度、尿κ/λ的比值結果見表2和圖2。與尿蛋白異常的非MM病人及尿蛋白正常的非MM病人相比較，MM病人的偏離明顯，P<0.01。與尿蛋白正常的非MM病人相比較，偏離更明顯，P<0.01。但是，尿蛋白異常的非MM病人κ/λ的比值與尿蛋白正常的相比較無明顯差異，P=0.215，不具統計學意義。

2.3 血清免疫球蛋白定量結果 33例MM患者的血 κ、血 λ 的濃度(見表 3、圖 7、8），血 κ/λ 的比值(見圖9）與43例非MM患者相比較見，偏離非常明顯，P<0.01，具有顯著的統計學差異（見表3）。

3 討論

MM系骨髓中惡性漿細胞過度增殖，導致血清或尿液中出現單克隆性免疫球蛋白或其輕鏈、重鏈的一種疾病。正常人血清中，免疫球蛋白分子是由多克隆性質的漿細胞按一定比例合成的，因此血清中Ig及κ、λ輕鏈保持在一定范圍內。在MM發生后，Ig合成受影響，異常增生的腫瘤細胞產生了大量的單克隆Ig及其片斷。因此測定血清及尿中的單克隆免疫球蛋白在MM的診斷及療效評估中具有重要的指導意義。

圖2 33例MM患者、19例尿蛋白異常的非MM病人（腎病病人）和38例尿蛋白正常的非MM病人的尿白蛋白、尿IgG、尿κ、尿λ的濃度、尿κ/λ的比值結果分布

圖3 血清κ輕鏈、λ輕鏈及κ/λ比值結果分布

本研究中，尿本周氏蛋白電泳陽性的33例MM患者，其SPE結果顯示9%的病例M蛋白呈單株峰，其中4例輕鏈型MM在γ區看不到M蛋白區帶，2例IgA和1例IgG在γ區可見彌散的M蛋白區帶，但這7例MM患者的血清免疫固定電泳結果（除1例κ輕鏈和1例λ輕鏈外）均可看到濃集、窄細、深染的M帶。33例MM患者血本周氏蛋白電泳陽性率僅有30%，遠遠低于SPE和IFE，但血本周氏蛋白電泳也有它自身的優勢，本周氏蛋白電泳每份標本共有 6 條泳道：ELP、GAM、κ、λ、游離κ、游離λ，ELP泳道相當于血清蛋白電泳，在結果判斷中起對照作用，GAM泳道加入抗IgG、IgA、IgM 3種免疫球蛋白重鏈的混合抗血清，該泳道出現克隆帶即提示3種免疫球蛋白的其中1種呈克隆增生。κ和λ泳道加入抗結合型和游離型輕鏈的混合抗血清，標本中只要有克隆性的輕鏈(與重鏈結合或游離于血中)存在，該泳道即出現克隆條帶。游離κ和游離λ泳道加入抗游離輕鏈抗血清，該泳道出現克隆條帶則提示標本中有單克隆游離輕鏈存在。因而4例輕鏈型MM在游離κ或游離λ泳道上可看到明顯M帶。在M蛋白篩查方面，由于單克隆免疫球蛋白的類型不同，其分子大小亦不同，因此在電場泳動的速率不同，導致單克隆成份可出現在 γ 區 (IgG、IgM 型)、α1、α2或 β 區（IgA型、輕鏈型），當單克隆成分不出現在γ區或其他腎病引起α2或β區升高時，SPE則有較大缺陷不能明確單克隆成份的有無，對于這種情況需要IFE進行鑒別，IFE仍然是檢測M蛋白的金標準[12-14]。血本周氏蛋白電泳是在免疫固定電泳的基礎上利用了抗游離κ和抗游離λ抗體檢測血清中的游離輕鏈，因此，IFE結合血清本周氏蛋白電泳可進一步提高MM分型的陽性率。

表2 33例MM患者分別與19例尿蛋白異常的非MM病人、38例尿蛋白正常的非MM病人相比較（M±SD）

表3 33例MM患者與43例非MM患者血本周氏蛋白相比較（M±SD）

據文獻報道， 尿液中 κ/λ 在 0.75～3之間可排除單克隆輕鏈增多，當 κ/λ＜0.5 或 κ/λ＞5 時可以肯定尿中單克隆輕鏈增多，因此測定κ與λ的濃度并計算κ/λ的比值在MM的診斷上有重大意義[15-18]。本研究中33例MM患者尿液中κ或λ的濃度遠遠高于對照組，及κ/λ的比值也遠遠偏離0.75～3范圍。對照組中，尿蛋白異常的非MM病人κ/λ的比值與尿蛋白正常的非MM病人相比較是沒有統計學意義的，也就說尿蛋白異常的病人包括腎病病人、結締組織病病人、淋巴瘤病人等，尿液中κ與λ的濃度會增高，但一般不會超過100mg/L，而且是按一定比例增高的，其比率維持正常。尿本周氏蛋白電泳作為MM的篩查手段，其結果的判斷存在許多不確定的因素，在一定程度上影響MM診斷的準確率。然而利用散射免疫比濁法對尿液中的κ和λ定量并計算κ/λ比值，對提高臨床MM診斷效率有很大的幫助。

外國有研究表明， 血清 κ/λ 比值采用 0.3～2.0的參考范圍可早期發現低產量M蛋白的MM，還可進行療效判斷，預后監測等[9，19]。33例MM患者血清中κ或λ明顯升高，κ/λ的比值遠遠偏離正常對照值，具有顯著的統計學差異。血清中κ與λ的量反應的就是腫瘤的負荷關系，因此測定血清中κ與λ的濃度及κ/λ的比值可以很好地評價MM患者的體液免疫狀態。