lncRNA在豬上的研究進展

馮韶華 曹洪戰蘆春蓮

（河北農業大學動物科技學院，河北保定 071000）

2002年，Okazaki等[1]在對小鼠測序過程中最早發現了長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）。最初，研究者認為lncRNA是非編碼RNA，不具有任何作用，僅僅是轉錄中的副產物，沒有生物學功能。而后隨著大量lncRNA被發現，人們逐漸改變了對lncRNA的認識，它不僅在轉錄前、轉錄中和轉錄后參與各基因組的轉錄活動，還影響一些蛋白質的編碼活動。因此，當前對lncRNA的研究進入了火熱的階段。

1 lncRNA簡述

具有調節作用的非編碼RNA分為lncRNA和短鏈非編碼RNA，lncRNA的核酸長度大于200 nt。哺乳動物中50%的DNA能轉錄成RNA，RNA中僅有1%～2%能夠被轉錄為蛋白質編碼RNA，其余的則會被轉錄為非編碼RNA，因此研究非編碼RNA的功能和機制有助于加快動物或植物的遺傳進展。根據lncRNA在基因組中與蛋白質編碼基因的相對位置，將其分為5類：正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因內lncRNA和基因間lncRNA[2]。lncRNA是一類功能性RNA分子，位于細胞核或細胞質內，以RNA形式在多種層面（如表觀遺傳學、轉錄調控及轉錄后調控等）調控基因的表達水平[3]。自lncRNA被發現以來，其研究熱度一直在持續。

2 lncRNA的研究方法

目前，lncRNA的研究方法已逐漸成熟，研究者不斷探索新的方法對lncRNA進行深入研究，尤其在人類疾病研究中取得了較大的進展，當前已建立了許多相關的lncRNA數據庫。篩選lncRNA的研究方法主要有2種：⑴高通量測序，通過測序不僅能夠獲得lncRNA，也會獲得其他轉錄產物，高通量測序最有可能發現新的轉錄產物；⑵lncRNA芯片，目前芯片檢測主要用于人類疾病相關lncRNA的初篩。對lncRNA功能的研究方法主要有4種：⑴RNA干擾（RNA interference,RNAi），通過在細胞中特異性敲除相關lncRNA來檢測其功能作用，當lncRNA定位于細胞質時可采用此方法；⑵熒光定量逆轉錄—聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR），它可以檢測低拷貝數的RNA，具有較高的靈敏性；⑶實時熒光定量PCR（RT-qPCR），一般又可分為2類，一類為染料類，一類為探針類；⑷熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization），其優點是安全且靈敏度高。此外，對lncRNA機制的研究方法有RNA免疫沉淀技術（RNA immunoprecipi-tation,RIP），此方法可以研究與RNA結合的蛋白質的功能作用。

研究lncRNA的主要步驟分3步：⑴高通量測序以分析差異表達的lncRNA，基于RNA-seq技術對不同的動物組織進行測序，通過對結果的分析檢驗是否存在差異表達的lncRNA；⑵驗證測序結果并進行定位，測序后的結果可以通過相關網站比對，例如NONCODE等，確定所測序的基因序列及其所在位置；⑶確定功能，最后對lncRNA進一步研究，可通過建立lncRNA表達載體或沉默lncRNA的方法進行功能分析。

3 豬遺傳育種方面對lncRNA的研究

3.1 lncRNA在豬胚胎上的研究

胚胎發育是一個復雜的過程，胚胎發育后細胞進而分化為不同的組織或器官，最后發育為完整的個體。相關研究表明lncRNA可以影響豬的胚胎活動。2013年，Han等[4]對豬胚胎和胎盤中H19的表達進行了研究，發現孤雌胎兒和胎盤與正常受精卵中表達的H19不同。2016年，Li等[5]對豬受精卵植入前胚胎發育過程中的lincRNA進行了基因鑒定和分析，發現許多lncRNA與細胞周期的調控、轉錄和代謝活動有關，并能夠調節受精卵的基因活動。2016年李競宇[6]對豬早期胚胎的lncRNA進行了全面分析，發現其中有2個高表達的lncRNA對豬的胚胎發育有一定的影響。

3.2 lncRNA在豬繁殖上的研究

繁殖性狀是豬重要的經濟性狀，受到許多研究者和工作者的重視，通過深入研究繁殖性狀相關基因或蛋白質的關系，可以為豬的育種工作提供理論基礎，進而有效提高豬的繁殖力。2011年，Anna等[7]對伊比利亞豬和大白豬的睪丸進行了轉錄組分析，發現了一部分lncRNA的轉錄本和轉座子的組成；同時發現大白豬和伊比利亞豬參與精子發生和脂代謝的基因差異較大，說明大白豬和伊比利亞豬2個品種在繁殖力和脂肪沉積方面的表型差異一致。2016年，Ran等[8]對豬出生后30 d和180 d的未成熟和成熟的睪丸組織進行分析，發現這2個時間點之間存在許多差異，包括生精小管和間質結締組織的直徑，以及生精細胞和支持細胞的數量，然后對基因組進行測序，共檢測到了101個差異表達的lncRNA。2017年，Wang等[9]分析豬子宮內膜在妊娠和非妊娠時期的lncRNA和cRNA，結果表明2組間37個mRNA、34個lncRNA和1個miRNA差異顯著，進一步進行功能分析，發現這些RNA參與了細胞粘附、結合、核酸代謝等多種生物學過程。2017年，Weng等[10]對豬的睪丸發育過程進行了lncRNA鑒定，發現lncRNA的靶基因參與調控睪丸發育和精子發生的代謝途徑。

3.3 lncRNA在豬肉質上的研究

越來越多的消費者注重肉質的口感，肉質性狀作為豬的主要遺傳性狀，其遺傳力水平相對偏低，因此，需要分子輔助標記對肉質性狀進行輔助選育，進而改善肉質。2014年，Zhou等[11,12]對93個豬樣本進行RNA-seq，首次對豬lincRNA進行全面的分析；同時，對豬脂肪和肌肉中lincRNA的甲基化模式進行了研究，結果發現檢測到的某些lincRNA在豬脂肪和肌肉中表現出不同程度的甲基化，這為以后lincRNA在肉質中的進一步研究提供了理論支持。2017年，Liu等[13]對瘦肉型豬（杜洛克豬）和肥胖型豬（陸川豬）進行了lncRNA表達譜的分析，結果證明lncRNA在脂肪沉積中起調控作用。2017年，Sun等[14]使用 RNA-Seq和 miRNA-Seq檢測了長白豬和藍塘豬背最長肌中蛋白質編碼轉錄本和非編碼RNA的表達譜，發現了547個差異表達基因，這給不同肌纖維在不同品種間的發育提供了分子研究的參考依據。

3.4 lncRNA在其他方面的研究

lncRNA不僅可以調控動植物的生殖細胞，還可對豬的肌內脂肪造成一定影響，同時也對豬的某些疾病產生影響。2016年，Xia等[15]對高能量飲食誘導的非酒精脂肪性肝炎（NASH）小型豬的lncRNA進行分析，發現lncRNA可以影響NASH，多種差異表達的lncRNA可調控NASH相關靶蛋白編碼基因。2017年，Xing等分析淮南雄性豬肌肉中lncRNA對睪酮缺乏癥的影響時，發現lncRNA及其靶基因參與了睪酮缺乏癥相關的骨骼肌生長的調控。2018年，Yu等研究了lncRNA MEG3在骨骼肌發育中的影響，結果發現豬骨骼肌中MEG3序列較為保守，且會參與豬早期骨骼肌的分化和維持。2018年，Che等對豬脾臟相關lncRNA進行了研究，發現了不同發育階段的脾臟相關lncRNA具有較大的差異，這為研究動物脾臟的分子機制提供了基礎。

4 展望

目前關于lncRNA的研究大多還處于探索階段，lncRNA真正的作用機制還不明確，而且lncRNA在豬上的研究還較少，關于豬lncRNA的數據庫還不完善。ALDB（The domestic animal lncRNA database） 數據庫是針對家畜lncRNA所建立的，該數據庫可以為研究家畜的lncRNA提供參考。

未來如何研究豬lncRNA的調控機制，通過同一個體的不同部位或者不同個體之間的相同部位進行研究，仍需要研究者進一步的探索。當前，運用測序手段可以了解更多的未知lncRNA，進而為豬肌肉組織性狀、繁殖性狀等的研究提供理論依據。豬作為重要的家畜，不論在肉質性狀還是遺傳性狀方面對其lncRNA的研究都具有重要的意義，未來lncRNA在豬育種領域的研究中會是新的熱點。隨著對lncRNA的深入研究，其作用機制也會更廣泛地被人們所熟知。